重组病毒扩增和纯化
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1. 75cm2方瓶中接种 293 细胞,至密度达到 90%,加入适量病毒上清感染细胞。 3- 4d 后,细胞几乎变圆,且有一半细胞漂浮,则收集所有细胞。约500g 转速离心,弃上清。
2. 以灭菌 PBS 重悬沉淀,反复冻融4 次。4℃下 7000g 离心 5min.病毒纯化至少 需要 30 瓶 75cm2方瓶细胞。
3. CsCl 连续梯度离心纯化:50ml 离心管中称量 4.4g CsCl,加入 8ml 病毒裂解 上清液,混匀,体积约为10ml。转移至12ml 超速离心管(用于SW41 转头) 中,覆盖约2ml 矿物油。平衡后,10℃下 32000 rpm 离心 18-24hr,用注射器 抽吸离心出的病毒带。
(也可 CsCl 不连续梯度离心:20ml 超速离心管中缓慢加入 8mlCsCl 1.4 (53 g +87 mL 10 mM Tris-HCl,pH=7.9), 上面小心加入6 mL CsCl 1.2 (26.8 g + 92 mL ;10 mM Tris-HCl,pH=7.9), 再小心加入病毒上清液至体积达到20ml。平衡后,4℃下 23000rpm 离心 90min (SW28 转头) ,用注射器抽吸下层蓝白色病毒带)
4. 病毒透析去盐:配置透析液(10 mM TrispH 8.0, 2 mM MgCl2 , 5% sucrose),灭菌处理。4℃透析,更换3次透析液,可基本去除CsCl,病毒保存于- 80℃。