分子克隆的常用工具酶（组图）

限制和修饰现象在上个世纪中期被人们所发现，到 2005年1月，已经发现4342 种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有3681 种。限制性内切酶有特定的识别位点和切割位点，切割后可产生平末端或粘性末端。酶切有标准的反应体系，受末端长度的影响，有位点偏爱性，在极端非标准条件下会产生星星活性。通过酶切连接可以增减酶切位点，酶切位点在基因组中的分布是不均匀的。大肠杆菌有三种甲基化酶和三种依赖于甲基化的限制系统。

甲基化对限制酶切影响。基因操作常用的 DNA 聚合酶有大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ，T4、T7 DNA 聚合酶以及末端转移酶。为满足工作需要，还开发有 Klenow DNA 聚合酶，耐热 DNA 聚合酶以及反转录酶。除限制修饰酶和聚合酶以外，基因操作中还用到很多重要的酶，包括：连接酶、T4 多核苷酸激酶、碱性磷酸酶、核酸酶、琼脂糖酶、蛋白酶、溶菌酶以及一些 DNA 结合蛋白。

限制性核酸内切:能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段。

存在于细菌体内。

切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。

一、限制酶概念提出的背景

20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如E coli K株的噬菌体只能感染E coli K株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“限制现象”。

1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一种是核酸内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶。

能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶。

限制性核酸内切酶的分类

根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。

I 类：不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。

Ⅱ类：基因工程的工具酶。

Ⅲ类：切割位点不在识别位点，一般离识别位点25 bp～27 bp，对分子克隆操作亦无实用意义。

限制性核酸内切酶的命名原则

限制酶的命名是采用Smith和Athens提议的方案，即名称的第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字母，大写；第2，3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字母，小写；如果它的来源菌还有株系，则有第4个字母；最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号。前三个字母用斜体表示。

如Hind Ⅲ代表从流感噬血杆菌(Haemophilus influenzac) d株中分离到的第3个限制酶。

Ⅱ类限制性核酸内切酶

1 一般性状

分子质量为60 ku，单链多肽，最适pH为6～8；

NaCl有抑制作用，能被Mg2 激活，巯基有保护作用，

对热不稳定，通常是溶于含有50％甘油的缓冲液中贮存于–20℃环境下。取出使用时必须立即置于冰浴中。

2 识别序列

它对底物要求有特异的序列，通常的识别序列是4 bp ～6bp，有些则为7bp～8bp，甚或多于8bp。

多数限制酶的识别序列为回纹结构，在识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键。

3 酶切切口

有些酶在识别序列内的对称轴上切割，其切割产物具平头末端；

很多限制酶不能精确地在2个对称轴部位切割，而在识别序列2条链对应位上错位切割，切割产物有些形成5’-突出的粘性末端, 另一些为3’-突出的粘性末端。这些粘性末端的任何一侧都能和另一末端互补配对，使任何含有该识别序列的DNA分子都能和另一个含相同识别序列的DNA分子容易地连接成新的重组分子。

4．贮存与应用

限制酶对热不稳定，贮存于-20℃。