用于胚胎干细胞中饲养层细胞的原代培养
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实验材料
12.5d孕鼠、PBS、DMEM、血清、酒精、双抗、解剖器、培养箱、超净台
实验步骤
1.性成熟小鼠合笼(♀∶♂=2∶1)
2.每天观察小鼠,见阴道栓后确定为怀孕0.5d。
3.取12.5d孕鼠,断颈处死,在酒精中泡数秒消毒。控干酒精后置于一个无菌的培养皿中。
4.无菌条件下暴露子宫。每打开一层要换一套解剖器材(皮肤&腹膜)。
5.提起双角子宫,再用一套新的解剖器剪去多余的子宫膜,剥离出胚胎,PBS洗三次。剪去胚胎头部、四肢和腹部以及发育的内脏,只留下背部的中胚层(以成纤维细胞为主)。
6.将剩余胚胎尽量剪碎,小于1mm3,再用PBS洗三次,尽量弃去红细胞。
7.在组织块中加入血清(含双抗),然后转移到方瓶中。
8.在方瓶底部将大约25个组织块铺在瓶底,将方瓶倒置放入培养箱中,让组织块靠血清的作用粘附于瓶底,3h后,将方瓶正常放置,并加入DMEM培养。
9.3天后,观察结果。