用于胚胎干细胞中饲养层细胞的原代培养

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实验目的
能独立的进行原代培养 ，争取一次成功。

实验原理
原代培养（primary culture）是指直接从集体获取器官、组织后，通过组织块长出单层细胞，或者用酶或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养可认为是原代培养。与此相对应的是传代培养（subculture）。培养的细胞的生存环境（如方瓶）是有限的，当细胞增殖到一定密度后，需要分离出一部分细胞并更新培养基。传代培养就是指着中分离培养的程序。原代培养物在首次传代时即为细胞系（Cell line）。
因为原代培养的细胞是刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这种方法可以研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养 创造条件。利用此方法还可以直接服务于临床实践。如对肿瘤细胞进行原代培养，然后筛选出最有效的化疗方案。
原代培养分为消化法和组织块培养法。本实验所使用的是组织块培养法。

实验材料
12.5d孕鼠
PBS DMEM 血清 酒精 双抗
解剖器 培养箱 超净台

实验步骤
1.性成熟小鼠合笼（♀∶♂=2∶1）
2.每天观察小鼠，见阴道栓后确定为怀孕0.5d。
3.取12.5d孕鼠，断颈处死，在酒精中泡数秒消毒。控干酒精后置于一个无菌的培养皿中。
4.无菌条件下暴露子宫。每打开一层要换一套解剖器材（皮肤&腹膜）。
5.提起双角子宫，再用一套新的解剖器剪去多余的子宫膜，剥离出胚胎，PBS洗三次。剪去胚胎头部、四肢和腹部以及发育的内脏，只留下背部的中胚层（以成纤维细胞为主）。
6.将剩余胚胎尽量剪碎，小于1mm3，再用PBS洗三次，尽量弃去红细胞。
7.在组织块中加入血清（含双抗），然后转移到方瓶中。
8.在方瓶底部将大约25个组织块铺在瓶底，将方瓶倒置放入培养箱中，让组织块靠血清的作用粘附于瓶底，3h后，将方瓶正常放置，并加入DMEM培养。
9.3天后，观察结果。

实验分析
我们看到用胚胎成功的培养出了成纤维细胞，这说明幼嫩的组织很容易的做原代培养。而与此相对应的，用肝、肾并未成功的原代培养，这是因为肝、肾的细胞已经高度分化，丧失了分裂增殖能力，所以并不适用于原代培养。适用于原代培养的细胞还有肿瘤细胞和干细胞。肿瘤细胞本身就有很强的分裂能力，而干细胞还为分化，所以也有很强增殖能力。所以，在做原代培养实验时，我们应选择胚胎、幼嫩组织、肿瘤细胞以及干细胞等繁殖能力较强的组织或器官。
在细胞的原代培养时，重要的因素是减少细胞独立存在的时间，减小细胞的损伤，整个操作要迅速轻柔。当细胞离开机体时，因为没有营养，其生命力是随着时间而降低的。当我们在实验中断颈处死小鼠时，小鼠进入了临床死亡的阶段，即心脏死亡和肺死亡。也就是说，心脏和呼吸的永久或不可逆的停滞，肌体对各种刺激不起反应，同时伴有脑死亡，即全脑功能丧失并发生不可逆的改变。但这是小鼠的一些组织细胞还是有活性的。我们就是要趁这段时间赶紧做原代培养。所以，在组织或器官离开机体到浸入血清的时间要尽量短。特别是对于神经系统的细胞，它们的活性最脆弱，往往只有几个小时，所以必须尽量快地完成原代培养。如果肌体已经发生了生物学死亡，即死亡的最后阶段，也就是细胞死亡和分子死亡，那么，就无法进行原代培养了。在用酒精浸泡小鼠的步骤中，时间不宜过长，因为酒精对细胞有一定的伤害作用，影响原代培养的效果。
在这个实验中要非常注意的是无菌操作，其要求要高于外科手术。在实验中，要特别注意，每一个解剖层次都要换一到解剖器，在解剖一个层次时不要碰到另一个层次；带无菌手套，培养皿要用其盖子遮掩，防治空气中尘埃落入；整个操作要在酒精灯旁等。我培养的细胞在观察室已经看到由霉菌的污染。这可能是因为瓶盖不严，有培养基洒出，或者是因为试验当天我精神不好，操作不当造成的。但索性观察时污染还不严重，我还观察到了部分生长出来的成纤维细胞。
在运用组织块法时，应待到组织块略干燥，粘附于瓶壁上时再使之与培养基接触。否则，组织块会漂浮在培养基中，细胞不易生长。组织块不宜过大，因为组织块在肌体中是靠毛细血管来营养，而在培养时，因为组织块没有的毛细血管，故大的组织块内部容易腐烂；而过小的组织块也会影响其贴壁，所以，组织块的大小要适中，并不是越小越好。
细胞原代培养有很多的重要的用途。首先，原代培养的细胞更加接近于细胞在肌体中的真实情况，更能反映真实的生理生化特征。原代培养的细胞可以在临床上、制药上作为筛选药物的材料，也可以用它来研究细胞的生理特性，如细胞信号转导和凋亡的分子机理。其次，原代培养液是细胞系建立的必经的阶段。但是应该注意到，原代培养的组织是由多种细胞成份组成的，成分比较复杂。即使同一类细胞，如上皮细胞或成纤维细胞，也仍然具有异质性（heterogeneity），在分析细胞生物学特性上较为困难；其次，由于供体的个体及其他一些原因，细胞群生长的效果有时也不一致。在这时，可以用96孔板来获得单细胞的集落。这样就可以避免上面的缺点。