幼稚T淋巴细胞的小鼠干细胞病毒(MSCV)感染实验方法
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一、材料与试剂
1. 小鼠
2. 抗CD3与抗CD28抗体(Biolegend,100302,102102)
3. 白细胞介素-2(IL-2)(R&Dsystems402-ML-020)
4. 聚凝胺(Polybrene)(hexadimethrinebromide,SIGMAH9268)
5. RPMI-1640培养基(GIBCO,11875-093)
6. FBS(GEMBIO900-108)
7. 青霉素/链霉素溶液(GIBCO15140-122)
8. 2-巯基乙醇(Invitrogen21985-023)
9. PBS溶液(1XPhosphateBufferedSaline,GIBCO10010-023)
10. 小鼠干细胞病毒MSCV(Clontech634401)
二、设备
1. 24孔板
2. 离心机
3. 水浴
三、实验步骤
1. 用抗CD3与抗CD28抗体包被24孔板过夜。
向24孔板每孔加入400 μl PBS含有1 μg/ml 抗CD3抗体和0.5 μg/ml 抗CD28抗体。在盖子或封口上封上封口膜,保持在4℃黑暗过夜。第二天,吸除去抗体,每孔加入400 μl RPMI-1640培养基,不要让板干燥。
2. 杀死小鼠并将CD4+CD44loCD62Lhi幼稚T细胞分类。
3. 24孔板PRMI-1640培养基中每孔播撒5×106细胞,培养细胞过夜。
4. 按1:2比例分配细胞(把一个孔的细胞分成两孔),加入IL-2至终浓度50 U/ml,培养6 h(37°C,5%CO2)。
5. 1 200RPM旋转板5 min(室温),吸除培养基,并加入1 ml 含有适量MSCV颗粒的RPMI-1640(病毒浓度取决于多于106 cfu/ml 的titter)以及5-10 μg/ml3。 聚凝胺。2 500RPM旋转板90 min(37°C)。
6. 除去上清液,加入RPMI-1640培养基供分化或增殖。