细菌单克隆剪切步骤
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1. 取第二轮筛选得到的阳性克隆贮存液上清。
2. 将过夜培养的 XL1-blueMRF' 细菌 2000 转/ 分离心 10 分钟,将细菌溶解在10mMMgSO4 中,调整细菌溶度到 OD600=1.0。
3. 在一个 EP 管中加入:200ul XL1-blueMRF' 细菌+250ul phagestock(步骤 1)+1 ul ExAssisthelper phage。
4. 将以上三种样品混合,37℃下共同保温 15 分钟。
5. 将样品混合物加入到 3 ml LB 培养基中,37℃震荡培养 3-4 小时。
6. 将试管放于 65-70℃水浴 20 分钟,3000 转/ 分,离心 15 分钟。
7. 将上清转入新的离心管中,已发生剪切的 phageparticles在上清中(上清可在 4℃下储存 1-2 月) 。
8. 将 100ul phage 上清+200ul SOLRcells(OD600=1.0)混合,37℃保温 15 分钟。
9. 取步骤 8 中溶液 5- 10 ul 涂于 LB-ampagar plates(amp=50ug/ml) ,过夜培养。
10. 第二天细菌长出,随机挑取单克隆接种到 LB-amp 培养基中培养过夜。
11. 过夜培养细菌分为三部分:
① 提取质粒做双酶切,鉴定外源基因的大小;
② 送样品进行 DNA 测序
③ 加入 30-40%的甘油进行保种,分装成小份储存于- 80℃备用。