单克隆抗体的标记种类及操作步骤

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抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。

一、酶标记

1、辣根过氧化物酶(HRP)标记

辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆 抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。

程序一：

(1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。

(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。

(3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml)，混匀。

(4)称取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。

(5)用少许PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。

(6)将交联物过Sephadex G200或Sepharose 6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。

(7)酶结合物质量鉴定：

克分子 比值测定

酶量(mg/ml)=OD403×0.4

IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62

克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。

标记率=OD403/OD280

酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性。

(8)HRP抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融;或加入等量60%甘油4℃保存;不宜加NaN3或酚防腐，否则会影响酶活性。必要时冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。

程序二：

(1)将5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温搅拌作用1小时，以封闭HRP分子上的α和ε氨基。

(2)再加1ml 0.06mol/L 过碘酸钠溶液，在室温中避光轻搅30分钟，溶液呈黄绿色;随后加1ml 0.06mol/L 乙二醇，轻搅1小时，中止氧化反应。

(3)移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/L PH9.5碳酸盐缓冲液中，4℃透析过夜，更换三次缓冲液，注意避光。

(4)吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mg IgG的碳酸盐缓冲液1ml，室温轻搅2-3小时，避光;加入5mg NaBH4 ，4℃放置3小时或过夜，或换用乙醇胺(2mol/L PH9.5)0.2ml，作用7小时。

(5)再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小时，更换三次缓冲液。

(6)用3000r/min离心30分钟，除去沉淀物。上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次，沉淀用少许PBS溶解，透析或层析除盐，必要时进一步层析纯化。

(7)、(8)步骤同程序一。

2、碱性磷酸酶(AP)标记

碱性磷酸酶(AP)用于标记抗体，常用戊二醛一步法，将酶和单抗混合，再加入适量戊二醛，使酶和抗体蛋白的NH2分别与两个醛基结合，制备成结合物。该法简便，但所得产物不均一，抗体活性损失大，酶标记率低。其程序如下：

(1)将5mg AP加入1ml抗体溶液(2mg/ml)中溶解，装入透析袋，于4℃对0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小时，换液三次。

(2)加入2.5%戊二醛20ul，室温作用1-2小时，4℃对PBS透析过夜，其间换液三次。

(3)换用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。

(4)取出标记抗体，用含1%BSA的Tris-HCl缓冲液稀释至4ml，即为AP标记物原液。

(5)每毫升中加入0.4ml甘油，小量分装，保存备用。

3、PAP、APAAP的制备

PAP(过氧化物酶-抗过氧化物酶桥联酶标技术)、APAAP(碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标技术)的制备对于日益广泛使用单抗的免疫细胞化学有重要意义。现在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊和兔PAP、APAAP试剂供应，只要配以相应的桥抗体，即可非常便利地应用单抗。因为PAP法和APAAP法不用任何化学交联剂处理酶和抗体，它们的活性均不受化学因素的影响，提高了敏感性和特异性。PAP和APAAP试剂的制备方法常采用先将HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或单抗中而获得免疫沉淀物，再加入酶盐水，过量的酶有助于免疫沉淀物的解离反应，调PH至2.3，随后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半饱和硫酸铵，纯化PAP或APAAP。

根据需要还可将PAP和APAAP试剂先与相应桥抗体结合后，再与特定单抗组成完整的诊断试剂，这样，单抗即可一步法用于诊断或检测试验等。

二、荧光素标记

1、异硫氰酸荧光素(FITC)标记

FITC标记抗体的原理是在碱性条件下，FITC 的异硫氰基能与IgG的自由氨基结合，形成IgG与荧光素的结合物。FITC是最常用的荧光素，其次选用TRITC(四甲基异硫氰酸罗丹明)。FITC和TRITC是常用的双标记组合。其标记步骤如下：

(1)以碳酸盐缓冲液(PH9.3，Na2CO3 8.6g，NaHCO3 17.3g，蒸馏水1000ml)调整抗体浓度至10mg/ml。

(2)取5ml抗体溶液置于10ml小烧杯中。

(3)称取1mg FITC溶于0.2ml DMSO中，待溶解后立即缓慢滴加于抗体液内，边加边轻搅;其后室温避光作用2小时。

(4)将交联物经Sephadex G25或G50柱层析除去游离的荧光素;分管收集第一峰为标记的抗体。

(5)FITC的结合物质量鉴定

IgG量(mg/ml)=(OD280-OD495×0.35)/1.4

F/P=2.87×OD495/(OD280-OD495×0.35)，一般说，FITC对抗体的摩尔比为3：1时适合于组织切片染色，为5-6：1时适合于细胞悬液染色。以标记抗体染色各种抗原，测定其特异性染色滴度和非特异染色的程度。

(6)标记抗体的保存：宜保存于4℃，加NaN3防腐。

2、异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记： 基本与FITC标记相同。

三、同位素标记

必须强调的是在使用同位素标记单抗或其他蛋白之前，应掌握同位素操作和防护知识。正常情况下应包括避免物理的接触和对γ-射线照射的有效保护，操作和使用同位素标记抗体时，应利用防护装置，并合理处置含放射性的废料。

1、碘标记

用碘标记抗体是一种有效的标记方法。125I衰变产生低能的γ和Χ射线，很容易被检测出来，而其60天的半衰期保证足够的有效使用期，且能很方便地处理放射废料。最常用的碘标记方法是氯胺T法，即将氧化剂氯胺T加入到抗体和碘化物的溶液中，Na125I在氯胺T作用下I转化成I2，游离I2可与抗体分子中酪氨酸和一些组氨酸发生卤化反应，用还原剂和游离酪氨酸终止反应，经凝胶过滤将标记的抗体与碘化酪氨酸及还原剂分离开。其主要操作步骤如下：

(1)在进行标记之前，先选用截流分子量为20000-50000的凝胶，制备1ml凝胶柱，然后分别用10倍体积的1%BSA/PBS/0.02%叠氮钠和PBS洗涤柱体，封住柱下口，备用。

(2)加入10ug纯化单抗至含有25ul 2.5mol/L磷酸钠(PH7.5)的1.5ml指形管内。随后，加入500uCi Na125I混匀。

(3)加入25ul新配制的2mg/ml氯胺T。室温放置60秒。再加入50ul氯胺T终止液(含2.4mg/ml偏重亚硫酸钠，10mg/ml酪氨酸，10%甘油和0.1%环乙烷酰二甲苯的PBS)。

(4)将上述碘标记物上样在凝胶柱表面，小心放开柱体下口，用1.5ml指形管收集。当碘标记物全部进入柱体，加入0.3ml含0.03%叠氮钠的PBS，用另一指形管收集0.3ml，然后再加0.3ml 0.03% NaN3 PBS，下口收集0.3ml，重复进行，同时用同位素检测仪测定标记与未标记的单抗。标记抗体大约在第二至第四管出现。无害化处理柱子和非单抗标记部分。

(5)将标记单抗保存于4℃可使用6周时间。

2、生物合成法标记

将杂交瘤细胞培养在含有放射性前体的培养基中，随着抗体分子的合成、组装，同位素会标记在抗体分子的初级氨基酸链上，本方法不会导致抗体活性的丧失。其主要步骤是：

(1)离心收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，约需2×106个细胞。以预热37℃不含甲硫氨酸的培养基洗涤上述细胞。

(2)用含2% PBS不含甲硫氨酸的培养基悬浮杂交瘤细胞至106个/ml，加入35S甲硫氨酸(每次加入100uCi可产生105-106cpm的抗体)。

(3)经C02培养箱中培养过夜，离心后，吸出培养上清，分别加入1/20体积的1mol/L Tris(PH8.0)及叠氮钠至浓度0.02%。该标记抗体可按纯化单抗方法进行。

四、生物素标记

生物素标记反应常用生物素琥珀酰亚胺酯进行。生物素是与抗体分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完成标记。其主要步骤是：

1、用二甲基亚砜配制10mg/ml的N-羟琥珀酰亚胺生物素(应根据需要选用不同大小和间臂长的生物素化琥珀酰酯)。

2、用硼酸钠缓冲液(0.1mol/L，PH8.0)稀释单抗溶液至1-3mg/ml。

3、每毫克抗体加入25-250ug的生物素酯，混匀后，室温作用4小时。

4、按每250ug生物素酯加入20ul 1mol/L NH4Cl终止反应，室温放置10分钟。

5、以PBS充分透析除去游离生物素，标记抗体冻存。

五、其他标记技术

适用于蛋白质的其他标记方法也可用于单抗，如金标记、化学发光标记、SPA标记、铁蛋白标记等。

免疫标记是一种操作简单、灵敏度高的技术，主要原理是级联方法效应。单抗已经广泛用于疾病诊断等，主要是利用单抗标记的诊断试剂盒进行的。