材料与仪器
T4 DNA 连接酶 感受态细胞
Taq 聚合酶 PCR 缓冲液 溴化乙锭（EB) 溶液 过硫酸铵（APS) 水溶液
琼脂糖凝胶
Taq 聚合酶 PCR 缓冲液 溴化乙锭（EB) 溶液 过硫酸铵（APS) 水溶液
琼脂糖凝胶
步骤
3.1 克隆
NExT 混编过程中，使用包含限制性酶切位点的混编引物的配对位点应设置在紧挨着目标基因的两侧，理想的退火温度为 60°C 左右。通过 4 加 2 法则估算引物的退火温度：每个 G 碱基和 C 碱基为 4°C，A 碱基和 T 碱基为 2°C。
我们在 NEXT 混编过程中使用的基因包括：含 657 个碱基的野生型 CAT 基因 ( CATwt；SwissProt 编号： P00 483；蛋白质数据库（PDB) 编号：1NOC：B)，编码 N 端 10 个残基截短的突变体，C 端 9 个碱基截短和 N 端、C 端双截短 CAT 突变体 ( CAT_Nd10，CAT_Cd9 和 CAT_ Nd10_Cd9 ) 以及 C 端 26 个碱基截短突变体( CAT_Cd26)。这些基因和全部的混编基因都克隆到质粒载体 PLiSC-SAFH1 上[7]，使用 Xba l 和 Hind III 双酶切位点替换原始质粒的部分片段。多样性的产生则通过易错 PCR 和尿苷酸交换 PCR ( 见 10.3.2 节）。扩增野生型和 N 端截短的基因使用 Pr-Nshuffle ( 5'- ATTTCTAGATAACGAGGGCAA-3' ) 和 Pr-C-shuffle ( 5’- ACTTCA CAGGTCAAGCTTTC-3'）混编引物；而对于扩增 C 端截短和双截短突变体的基因则使用 Pr- N-shuffle 和 Pr-Cdx-shuffle (5’-CTTCACAGGTCAAGCTTATCA-3’）引物。通过常规方法将这些质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中 [8]。
3.2 尿苷酸交换 PCR
选择尿苷酸作为交换核苷酸，因为许多种 DNA 聚合酶都可将 dUTP 引入基因序列 [9]。尿苷酸交换 PCR 在扩增目标基因库的同时，也引入了交换核苷酸，尿苷酸。通过改变 dUTP: dTTP 的比率可获得理想的 DNA 断裂效果。这一步骤的实现即可通过分析不同 U:T 比率的实验，详见 10.3.4 节，也可使用我们为此目的开发的程序（见 10.3.9 节）。使用高达 50% 比率的 dUTP 并不影响 PCR 产物的得率。只有在完全使用 dUTP 的情况下，PCR 产物的产量大约为其他反应的 1/4 ( 图 10.1A )。
( 1 ) 为精确加样量，将 100 mmol/L 核苷酸储液用水稀释到 dATP、dGTP 和 dCTP 的终浓度为 10 mmol/L ，dUTP 和 dTTP 终浓度 1 mmol/L。
( 2 ) 尿苷酸交换 PCR 混合液包括：50 ng 模板（对含 4340 个碱基的质粒为 0.017 pmol)，引物各 25 pmol，dATP、dGTP 和 dCTP 各 0.4 mmol/L，0.4 mmol/L dUTP : dTTP 不同比率的混合物，5U Tag DNA 聚合酶，5 μl 10 X PCR 缓冲液。用水加至终体积 50 μl ( 见注 1 和注 2 )。
( 3 ) 温度循环程序为 94°C 预变性 1 min；92°C 变性 30s，62°C 退火 20s，72°C 延伸 2 min，共计 25 个循环；最后 72°C 再延伸 4 min。其中将延伸时间延长至 2 min 是因为测试表明这样可以显著的提高产量（数据略去）。根据 PCR 的不同产量，需同时做 4 个或更多的 50 μl 反应体系以获得足够的产物（胶回收后应最好约为 7 μg DNA；见注 3 )。
( 4 ) 将得到的 PCR 产物合并，并通过 1% 的琼脂糖凝胶电泳分离纯化（见注 4)。如果量足够多的话，在日光下即可从胶上看到浅红色的条带。将条带切割下来后加到一两个胶回收试剂盒的离心柱中，用 50 μl 洗脱缓冲液洗脱。
( 5 ) 使用波长范围 220~350 nm 的分光光度计检测 260 nm 的基线校准吸光值，测定 PCR 回收产物的浓度。我们通常以 1 : 30 稀释后在 140 μl 的比色杯中测量。NExTDNA 混编产物最理想的得率为 7 μg DNA。更低的得率可能也行，但足够量的 DNA 可确保下一步的基因重组顺利进行（见 10.3.7 )。将所有理想的 DNA 都用于下步反应。
在这项研究中，我们均使用尿苷酸作为交换核苷酸，然而此项技术也同样适用于其他类似物的引入。例如，8- 氧化鸟嘌呤（8- oxoguanine) 可被 8-氧化鸟嘌呤 DNA 糖基化酶 FPG ( foramidopyrimidine-DNA glycosylate) 切除 [ 10 ]。该减基可用于 AT 富集区，那里 UDG 酶频繁的切割 DNA，也可用于缺少胸腺嘧啶的 GC 富集区。因此，将多种交换核苷酸结合在一起使用可以产生所需大小的片段，用于下一步的再组装。另外，在 PCR 引物中引入交换核苷酸应确保基因库中的这些区域同样被混编。
3.3 酶解反应和化学切割
将尿苷酸交换 PCR 纯化后的产物进行 UDG 酶解反应，在交换核苷酸位置切割 DNA。该酶对双链和单链 DNA 均有效，通过对双脱氧尿苷 C1' 位点的亲核攻击引发水解反应，高特异的去除尿嘧啶基团 [12] 。哌啶用于经 UDG 酶切割去除尿嘧啶后的骨架部分 [13]。通过高分辨率尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析上述切割反应的结果，其中 dUTP 的比率从 100% 到 0% 不等（图 10.1B )，进而再用图像分析软件定量（图 10.1C)。对于很小的片段，可通过引入放射性标记来更好地观测（见注 2 )。
( 1 ) UDG 酶解反应体系包括 45 μl PCR 纯化产物（含约 7 μg DNA，见 10.3.2 节步骤 4)，6 μl 10 X UDG 反应缓冲液，2 U 大肠杆菌 UDG 酶。加水至 60 μl，37°C 消化 1 h ( 见注 6 )。
( 2 ) 使用哌啶切割 DNA 反应体系包括终浓度为 10% ( m/V ) 的哌啶（60 μl 体系中加 6.7 μl 哌啶储液），在有加热盖子的热循环仪中 90°C 反应 30 min ( 见注 7)。
作为采用相对温和的反应条件的尝试，用其他的一些内切核酸酶替代哌啶切割骨架 DNA [11]，如内切核酸酶 IV [ 14 ] ，核酸外切酶 Ⅲ [15]，或 T4-内切核酸酶 V [16] 。我们检测了最后一种但否定了其使用。T4 内切核酸酶 V 切割 UDG 作用后的 DNA 结果得到的是不完全断裂，这从产物的大小分布可见（图 10.2A )。更麻烦的是这一反应必将引起高错误率的出现。应用 UDG 和 T4 内切核酸酶 V 切割 CAT 野生型基因，胶回收后进行重组装，送其中的 6 个克隆共计 3930 bp 去测序，结果突变率为 1.75%。对于这一结果我们给出了两个原因。首先，T4 内切核酸酶 V 是通过其裂解酶活性切割 DNA 骨架，其间催化了一个 β 消除反应，留下了 3' 端不饱和的醛基（4-羟基-2-戊醛）连在磷酸基团上 [ 11，17] 。进一步生成游离磷酸基的化学反应并未完成，如此产生的片段不利于聚合酶的起始。其次，通过片段比较发现，不是所有引入尿苷酸位点的骨架都完成了切割。但这些位置的尿嘧啶都被切掉了，这种碱基缺失的模板会造成错误核苷酸的引入。Miyazaki [18] 建议使用大肠杆菌内切核酸酶 V，但从提供的数据可见，切割的效率更低，即使延长切割时间（12 h) 并提高 dUTP 的比率（75% ) 仍不能获得短的片段。虽然可以设计进一步的实验解决这些问题，但因哌啶的切割即好又划算，就没有必要再做尝试。
作为哌啶的化学替代品，我们检测了氢氧化钠的效果。将哌啶储液替换为 0.5 mol/L 氢氧化钠溶液，加至 DNA 体积的 10% ( V/V ) ，90°C 反应 30 min。使用哌啶和氢氧化钠切割相同的尿苷酸交换 PCR 产物，比较二者变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后 EB 染色的结果。通过图像分析软件，得到的断裂片段的强度分布基本一致。平行进行的重组装反应也得到了相似的结果。这些都证明了哌啶引发的主要反应是碱催化的 β 消除反应，将两个余下的磷酸基从 DNA 的糖基上去除下来。因此，如果非常重视安全因素，可用氢氧化钠替代哌啶。然而我们未测序分析氢氧化钠切割片段重组装后的产物是否产生突变。原则上，哌啶更适合引发糖基上的亲核攻击，切割的效果也更为彻底。
3.4 尿素变性聚丙酰胺凝胶电泳
使用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析断裂片段的大小分布并纯化特殊大小范围的片段（见 10.3.5)。此步为备选步骤，仅对要求严格控制的断裂反应推荐使用。
( 1 ) 凝胶包含 6.7 mol/L 尿素，11%~12% 的聚丙烯酰胺和 1 X TBE 缓冲液 [8] 。分析胶的大小为 10cm X 8cm X 1mm，制备胶的大小为 10cm X 8cm X 2mm (见 10.3.5.2 )。因尿素降解会影响电泳效果，故要求所有的凝胶都新鲜制备。我们通常使用 31.5 g 尿素，29.2 ml 包含 30% 聚丙烯酰胺，0.8% 甲叉双丙烯酰胺（37.5 : 1 ) 的凝胶储液，17.1 ml 水，7.5 ml 10 X TBE 缓冲液，500 μl 10% APS 水溶液和 50 μl TEMED；这些足够在一个制胶器中同时制备 9 块分析胶（见注 8 )。
( 2 ) 电泳在 56°C 进行。我们使用 Hoefer Mighty 小型基础电泳槽（Amersham)，配接温度控制水浴锅。
( 3 ) 在 1 X TBE 缓冲液中将凝胶预电泳 10 min，电压 100V。
( 4 ) 将断裂 DNA 浓缩至 7 μl，加至 speed-vac 真空离心挥发哌啶，加 25 μl 去离子甲酰胺，在 PCR 仪中 80°C 加热 3 min ( 见注9 )。再加入 3 μl 60% 的蔗糖溶液和 7 μl 水帮助上样（见注 10)。最终上样量为 15~20 μl ( 约含 3 μg DNA ) 。
( 5 ) 寡核苷酸混合液和 100 bp DNA 标尺可作为分子质量标准（见注 11) 。至少一个标尺使用带染料的上样缓冲液。
( 6 ) 上样后 170 V 进行电泳，至标尺中的溴酚蓝距边缘还有 0.5 cm 时结束（见注 12 ) 。
( 7 ) 在 30 ml 1 μg/ml 的 EB 溶液（1 : 5000 稀释）中染色 5 min，紫外灯下观察（见注 13 ) 。
分析型凝胶电泳结果表明，断裂产生片段的大小分布具有固定的峰值，由 dUTP 所占的比率决定。如图 10.1B 所示，多个长度分布带很容易得到，包括很小的和大的片段，分别适用于短的基因和长基因簇的混编。这样的测试只用于最初确定合适的 dUTP 比率以获得目标的片段大小分布。最后确定测试库中 dUTP 使用的最佳比率为 33.3%，且结果的重复性很好。因此，在接下来的定向进化实验中，此步分析电泳可以省略。
3.5 片段纯化
经酶解和化学裂解得到的基因片段（见 10.3.3 ) 即可通过硅胶树脂直接从切割反应液中纯化（见 10.3. 5.1)，也可通过制备型尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化（见 10.3.5.2) 。
最初我们认为如想得到特定大小的片段必须通过凝胶电泳来纯化，以确保在重组装反应中没有较长片段甚或全长片段的参杂，以免影响碰撞概率。而实际上，如不经多轮的重组装反应，就无法从纯化的片段中直接扩增出全长产物，这表明切割反应进行的十分彻底（见 10.3.7) 。因此，只有对片段大小范围有十分严格的要求时才有必要 使用凝胶电泳纯化。
3.5.1 哌啶切割后直接纯化
( 1 ) 最简便的片段纯化方法就是使用 Qiaex II 试剂盒（Qiagen) 从哌啶切割后的反应液中直接纯化（见 10.3.3)。依据该试剂盒指南进行操作（见注 14)，加入结合缓冲液后中和（约 20 μl 3 mol/L 乙酸缓冲液）。
( 2 ) 清洗两次后，分两步加入 25 μl 洗脱缓冲液洗脱。将两次洗脱液混合。
( 3 ) 离心两次，每次换一个干净的离心管（见注 15)。
3.5.2 尿素变性聚丙烯酰胺凝肢电泳纯化
注意此步为可选步骤。尝试了两种方法从凝胶中回收片段。一种是经典的水提取后乙酸/镁离子沉淀法，另一种是使用 Qiagen 公司的 Qiaex II 试剂盒。但通过染色检测提取完基因后的凝胶，发现两者都存在提取不完全的问题。
( 1 ) 经制备型尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后（见 10.3.4，步骤 1 ) ，在低强度紫外灯照射下将目标大小的条带切割下来（图 10.2B)。放入离心管中充分捣碎后加入提取缓冲液（QiaexII 提取，步骤 2 ) 或 1 ml 水（水提取，步骤 3 )，放入热混合器（Eppendorf ) 中以 37°C，1000 r/min 过夜孵育。
( 2 ) 如果使用 QiaexII 提取缓冲液提取，见 10.3.5.1 节。
( 3 ) 如使用水提取，加 1/10 体积的乙酸缓冲液，1/100 体积的氯化镁和 1 体积的异丙醇沉淀 DNA；-20°C 反应 1 h；4°C 20000 g 离心 15 min；将沉淀重悬在 50 μl 90% 乙醇中，放入热混合器中 37°C，1000 r/min 反应 1 h；-20°C 放置 1 h；4°C 20000 g 离心 15 mm；将沉淀在空气中晾干后，加入 30 μl 加入洗脱缓冲液，37°C，1000 r/min 孵育 1 h。
为得到胶提取步骤的交叉率，我们设计了 3 个母本克隆（CAT_Nd10 突变体）的混编检测实验。其中两个克隆在 100 bp 范围内包含 1 个特异的突变，另一个在 100 bp 范围内包含 2 个特异突变。混编并经 Tag 酶扩增后挑选 8 个克隆测序，结果表明其中的 6 个克隆在 100 bp 范围内有一个交叉。这与直接快速纯化得到的交叉率可比 （ 见 10.3. 5.1 和 10.3.8 )。实验共测序了 3851 个碱基，发现了 12 处错误，突变率为 0.31%。这样的错误率比快速纯化的错误率高很多，可能是由于 UV 照射（哪怕是弱的 366 nm 的光源）或是凝胶中的化学修饰引起的。因此我们在最终的 NExT DNA 混编方法中，去掉了凝胶纯化的步骤，因为额外的工作并未带来益处，反而损失了产量，提高了错误率。
3.6 纯化片段的定量
为了分析和比较纯化得到的 DNA 的产量，我们首先使用 SYBR Greenn 试剂来定量。因为 NExT DNA 混编方法的重复率很髙，我们只定量一次即可（见注 16 )。通常我们都能获得浓度为 40~60 ng/μl 的 DNA 片段。
( 1 ) 取 2 μl 纯化的 DNA 片段（见 10.3.4)，加入 50 μl 1 : 5000 稀释的 SYBR GreenII 溶液染色，此染色液对单链 DNA 非常敏感（见注 17) 。
( 2 ) 在暗箱中反应 5 min 后检测荧光信号（我们使用 96 孔的 Perkin Elmer LS 50B 荧光粉光光度计；见注 18)。染料的激发波长是 480 nm，可在 515 nm 检测发射值。
( 3 ) 使用片段大小范围内的标准寡核苷酸，稀释不同的倍数绘制浓度标准曲线，标定片段所含 DNA 的浓度。
3.7 基因重组装和扩增
通过内部引物延伸反应从纯化的基因片段重组得到全长基因（见 10.3. 5)，其 间不断提高退火温度并最好使用具有校正功能的 DNA 聚合酶，如 Vent ( 图 10.3)。在内部引物延伸 PCR 过程中，片段之间可相互作为引物，因此每个循环反应后都会加长，直到最终得到全长基因。最后，通过常规 PCR 反应，加入两个末端引物对组装反应的产物进行扩增，构建克隆送测序。在方法建立过程中，通过琼脂糖凝胶电泳不断检测重组装反应结果（图 10.3 )。重组装反应在进行若干轮后停止，所得产物在此基础上进行 PCR 扩增。最后一步反应的基本原理与其他的基因组装进程相同，但有很重要的改变。尽管经历了剧烈的化学切割条件，使用了高保真 DNA 聚合酶的组装反应仍很高效。
( 1 ) 取出约 2 μg 的纯化 DNA 片段（见 10.3.5 ) 进行重组装。事实上如使用 Vent 聚合酶，少于 1 μg 的 DNA 片段都够用。通常我们都使用 20~25 μl 的片段溶液，无须检测浓度。
( 2 ) 在 DNA 片段中加入 4 μl ( 见注 19 ) 10 mmol/L 的 dATP、dTTP、d CTP 和 dGTP 的混合物（终浓度 800 μmol/L ) ，以及 4 U Vent DNA 聚合酶（NEB)，1~4 μl 25 mmol/L 的硫酸镁，5 μl 的 10X 反应缓冲液，加水定溶至 50 μl 。
( 3 ) 循环反应为 94°C 3 min；92°C 变性 30s，30°C 退火 60s，每轮增加 1°C ( 冷却率 1°C/s)，72°C 延伸 1 min，每轮多加 4s，共进 36 个循环；最终 72°C 再延伸 3 min。
( 4 ) 取重组装产物 10 μl ( 见注 20 ) 使用基因的合适引物（25 pmol 引物，0.2 mmo/L dNTP，25 个循环，40s 的延伸时间），进行常规 PCR 反应。
( 5 ) 使用适当的限制性酶切位点将扩增的基因克隆到载体上。
据我们所知，大多数已发表的片段重组装过程都使用 Taq 酶。Vent DNA 聚合酶的 3'→5' 校对核酸外切酶活性是基于其仅在 3' 端移除合成链上错配的核苷酸，直到聚合反应可以从退火的末端开始。这意味着核苷酸链上的点突变，即便是紧邻 3' 端的位置，都不会有问题 [19] 。为了比较这两种聚合酶的作用，分别使用 Tag 和 Vent 酶平行进行两组重组装实验，均使用相同的片段库作为起始。适量的重组装产物作为扩增 PCR 的模板，当使用 Taq 酶时，产物经琼脂糖凝胶电泳只有一条带，然后通过图像分析定量。结果，使用 Vent 酶的得到 DNA 产量为 Taq 酶的 35 倍。有意思的是，将使用 Tag 酶得到的 6988 个碱基测序，发现只有 5 个额外的突变（0.075% ) 。因此，在现有序列的统计误差内，使用 Tag 和 Vent 酶进行 NExT DNA 混编产生的错误率基本是相同的（见 10.3.8 )。关于两者产量的显著差别，可用校正酶的性质来解释。以 Vent 酶为例，该酶具有链置换活性 [ 20 ] ，这可能会帮助许多杂交反应的进行，另外 Vent 酶在 95°C 的半衰期约为 8 h，相对于 Tag 酶的 1.6 h [ 20 ] ，更适合长时间的重组装反应。另外，Taq 酶习惯在 3' 端多加额外的 dATP [21] ，这也是妨碍重组装反应进行的可能原因。除了上述因素，还发现 Tag 酶虽然适合片段的重组装反应，但其重组装的产物作为下一步扩增反应的模板，很难使用具有校正功能的 DNA 聚合酶进行扩增。
3.8 交叉率、片段的平均长度及突变率分析
将上面描述的 NExT DNA 混编技术应用在 600 bp 长的 CAT 基因的定向进化研究中，其中 N 端和 C 端分别截短 10 个和 9 个氨基酸残基（CAT_Nd10_Cd 9 ) 。实验中，挑选 12~383 碱基间具有不同突变模式的 5 个克隆与一个用于回交的截短野生型克隆相混合作为固定库，进行 33.3% 尿苷酸交换 PCR 来混编。从溶液中直接纯化片 段（见 10. 3.5.1 ) ，再经 Vent 聚合酶进行重组装反应（见 10.3.7 节）。在没有抗性选择压力的对照平板中挑选 8 个混编克隆进行测序（图 10.4A ) 。这些克隆独特的突变模式显示所有被检测的克隆都是从 2 ( 如克隆 1 ) ~4 个（如克隆 4 ) 母本克隆演化来的。在所涉及的 372 bp 的片段中，每 93~186 bp 就有一个交叉，平均片段长度为 114 bp。
通过测序结果计算突变率。在所测的 4425 个碱基中，发现了 4 个突变（一个 A 变为 G，一个 T 变为 C，1 bp 的插入和 1 bp 的缺失），计算突变率为 0.09%。这比之前报道的 DNA 酶混编的错误率 0.7% 要低得多。如 10.3.7 节中所述，并不是只有 Vent 聚合酶才能达到如此低的突变率。因为我们得到的片段大小分布和交叉率均与 DNA 酶混编的实验结果相当，因此分析前面报道的高错误率可能是由 DNA 酶解及凝胶观测时的紫外损伤引起的，而与片段大小和聚合酶种类无关。低突变率对长片段 DNA 的混编尤为重要，因为我们要尽可能地避免将功能异常的或不需要的分子引入基因库中。
进一步的实验中，挑选 4 个截短 CAT 基因（CAT_ Cd26 ) 母本进行了上述相同的混编实验，它们均包含一个突变，分布在 9~575 碱基，最终挑选 5 个克隆测序（图 10. 4B)。可检测的片段平均长度为 86 bp，其中包括许多短的片段。在 “对照 5”克隆中，突变位置分别相隔仅 6 个碱基（324 和 330 位置），12 个碱基（364 和 376 位置） 及 11 个碱基（404 和 415 位置）的突变体都被分开。这次实验得到片段的平均长度比之前的实验要小，这是因为更多的突变利于片段长度的检测。至于许多短片段的获得可能原因有两点：使用的 QiaexII 试剂盒可高效的回收短片段 DNA，或者基因扩增时的交叉是一个复杂的过程，包含如 PCR 基础上的链交换。
3.9 NEXT 片段断裂—预测程序
因为 dUTP 的掺入及产生的片段断裂都基于可推导的原则，我们开发了名为 NExTProg 的计算程序。该程序可预测双链 DNA 的 NExT 断裂模式，使得研究人员不需要实验就可设计合适的 dUTP: dTTP 比率。该程序通过读入 DNA 序列文件和 dUTP: dTTP 比值，就可算出所有可能的片段、它们出现的可能性及相对分布。给定 DNA 的互补链由程序自动生成并加入计算。计算后的结果以柱型统计图表形式显示，所有数据都可以列表形式输出以备使用（图 10. 5A ) 。当需要设定片段大小的上下限时（如凝胶纯化所需），程序可计算材料损失的可能性并调整每个片段的相对分布值。
3.9.1 数学原理
( 1 ) 设定给定 DNA 序列中的一个胸腺嘧啶被尿嘧啶替代的概率为 p。
( 2 ) 当两个胸腺嘧啶都被尿嘧啶替代时，就生成两者之间的片段，其概率为 p X p。
( 3 ) 只有当上述两个胸腺嘧啶间的 n 个胸腺嘧啶都不被替代时，片段才能存在，得到的概率为 p X p X ( 1-p）n。
( 4 ) 对于包含 1 个或 2 个 DNA 末端的片段，p X p 概率中的 1 个或 2 个 p 设为 1 ( 见注21)。
( 5 ) 为比较断裂结果，我们定义片段概率为除以所有值的和。
我们的计算方法与先前的计算都不同 [23]，因为我们考虑到片段的两个末端都需要产生，但不考虑诸如序列偏倚性和不确定的酶解条件等问题，这些会严重阻碍对 DNA 酶酶解的计算。
对于包含 x 个尿苷酸的基因，最多可产生可能片段 [ 根据高斯定理，当 x 为奇数时，等于（ x + 1 ) X （x + 2 ) / 2；见注 22 ]。因此，对于一个典型的包含 250 个胸腺嘧啶和 240 个腺嘌呤（在互补链中也计算为胸腺嘧啶）1000 bp 长的基因，很快程序计算产生 31626 + 29161 = 60787 个片段，包括它们的概率和序列。
因为大多数用户可能都对结果概貌感兴趣，该程序将所有具有相同大小的片段汇集在一起，将它们的概率加和，给出占所有概率加和的百分比对长度的分布，在程序中以 “％mol ”表示。为了将电泳条带可视化，通过某一片段的概率乘以其长度计算 “mass”分布。这些值被均一化，代表碱基比率，定义为 “ mass”，如在碱基对中固定长度，程序中显示为“ ％mass ”。片段序列的输出文件按出现可能性由大到小列出了所有的片段。同样的序列只列出一次，概率为它们的加和。
3.9.2 程序的校准及与实验结果的对比
在比较测量和计算的结果之前，有一个非常重要的值要考虑：就是交换 PCR 时聚合酶掺入尿苷酸对胸苷酸的比率。这个值可能不仅取决于 dUTP : dTTP 的值，也取决于使用的聚合酶类型、核苷酸的绝对浓度以及使用的缓冲液。因此当使用程序时，需要设定该值。尿苷酸的掺入量可用下列方法测量：直接的方法是通过放射性标记的 dUTP，计算 PCR 产物的放射能；间接的方法是定量分析断裂图谱。我们选择后者，因为它同时提供了与我们的软件相似的基本原则。但需要注意这种对资料的双重利用只有在断裂完全的情况下才有效。
为定量分析裂解实验，我们使用常用的条件（标准 Tag 聚合酶 [ 24 ] ，200 μmol/L dNTPs)。
( 1 ) 在尿苷酸交换 PCR 反应中（见 10.3.2，见注 2 ) ，使用 32P-dCTP 标记的 DNA。
( 2 ) 进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（见 10.3.4 ) 。
( 3 ) 通过成像仪对凝胶进行放射能成像（见注 23)。这避免了因小片段的低效染色造成的信号变形。
( 4 ) 将每条带都通过图像分析软件，如 QuantityOne ( BioRad ) 或 NIH Image/Scion Image/imagej ) 生成线密度曲线。
( 5 ) 从线密度曲线中计算出片段和放射标记的分子质量标准的相对迁移值。
( 6 ) 将代表标记物相对距离和长度的可变参数 a 和 b 代入方程：相对距离 = a X In (碱基对长度）+ b 。
( 7 ) 用上述公式将片段的相对距离值换算为核苷酸长度。
( 8 ) 通过结合整数的核苷酸长度值和将相应的强度信号平均化，将强度信号/连续长度分布转换为强度信号/整数（只列出分散的寡核苷酸长度）。
( 9 ) 通过将每个单独的强度除以强度总和，将分布均一化。
上述变性胶的放射能成像图见图 10.5B。强度均一化后表示为 “％mass”（ 见图 10.50。将这一实验与程序计算结果相比较确定的尿苷酸对胸苷酸的相对掺入值。程序计算中，设置的掺入值为 0.2~0.3，按 0.01 增长。当设置值为 0.26 时，实验和计算结果最为吻合，其中根据测量和均方根分析预测的片段大小范围为 10~150 个碱基， 而计算得到的可靠片段长度为 4~200 个碱基（图 10.50。当使用分子质量标准的范围时（20~100 个碱基），因子最佳的设置值为 0.25。很显然这些图谱重叠得很好，并且电泳条带中的峰和点都可以很好地解释（图 10.5B、图 10.50。重要的是，y 轴的值落在了不需进一步调整的位置。我们确信尿苷酸的掺入率是确定的，并且没有不完全断裂造成的影响，因为实验和计算得到的结果几乎一模一样，并且尝试了许多实验条件检测断裂情况。使 用 33.3% U 断裂的放射活性测量值与计算值也吻合得很好 。但使用 25% U 断裂的放射活性检测结果中产生了相当量的大于 100 bp 标准的片段，并且出现了一些因标尺问题引起的偏离。然而同样使用掺入率 0.26，与使用 EB 染色后的断裂结果相比较，考虑到凝胶染色的长度依赖性，结果十分吻合（图 10.5D ) ，其中 EB 染色因有合适的分子质量标准，对于较长片段更为准确。因为针对放射活性检测和 EB 染色的尿苷酸掺入 PCR 分别使用了不同的缓冲液（见 10.2.2)，多种 PCR 增强剂，如硫酸铵、吐温- 20 或 Triton X-100 的加入 对 dUTP 对 dTTP 的掺入率并没有显著的影响。
NExT 混编过程中，使用包含限制性酶切位点的混编引物的配对位点应设置在紧挨着目标基因的两侧，理想的退火温度为 60°C 左右。通过 4 加 2 法则估算引物的退火温度：每个 G 碱基和 C 碱基为 4°C，A 碱基和 T 碱基为 2°C。
我们在 NEXT 混编过程中使用的基因包括：含 657 个碱基的野生型 CAT 基因 ( CATwt；SwissProt 编号： P00 483；蛋白质数据库（PDB) 编号：1NOC：B)，编码 N 端 10 个残基截短的突变体，C 端 9 个碱基截短和 N 端、C 端双截短 CAT 突变体 ( CAT_Nd10，CAT_Cd9 和 CAT_ Nd10_Cd9 ) 以及 C 端 26 个碱基截短突变体( CAT_Cd26)。这些基因和全部的混编基因都克隆到质粒载体 PLiSC-SAFH1 上[7]，使用 Xba l 和 Hind III 双酶切位点替换原始质粒的部分片段。多样性的产生则通过易错 PCR 和尿苷酸交换 PCR ( 见 10.3.2 节）。扩增野生型和 N 端截短的基因使用 Pr-Nshuffle ( 5'- ATTTCTAGATAACGAGGGCAA-3' ) 和 Pr-C-shuffle ( 5’- ACTTCA CAGGTCAAGCTTTC-3'）混编引物；而对于扩增 C 端截短和双截短突变体的基因则使用 Pr- N-shuffle 和 Pr-Cdx-shuffle (5’-CTTCACAGGTCAAGCTTATCA-3’）引物。通过常规方法将这些质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中 [8]。
3.2 尿苷酸交换 PCR
选择尿苷酸作为交换核苷酸，因为许多种 DNA 聚合酶都可将 dUTP 引入基因序列 [9]。尿苷酸交换 PCR 在扩增目标基因库的同时，也引入了交换核苷酸，尿苷酸。通过改变 dUTP: dTTP 的比率可获得理想的 DNA 断裂效果。这一步骤的实现即可通过分析不同 U:T 比率的实验，详见 10.3.4 节，也可使用我们为此目的开发的程序（见 10.3.9 节）。使用高达 50% 比率的 dUTP 并不影响 PCR 产物的得率。只有在完全使用 dUTP 的情况下，PCR 产物的产量大约为其他反应的 1/4 ( 图 10.1A )。
( 1 ) 为精确加样量，将 100 mmol/L 核苷酸储液用水稀释到 dATP、dGTP 和 dCTP 的终浓度为 10 mmol/L ，dUTP 和 dTTP 终浓度 1 mmol/L。
( 2 ) 尿苷酸交换 PCR 混合液包括：50 ng 模板（对含 4340 个碱基的质粒为 0.017 pmol)，引物各 25 pmol，dATP、dGTP 和 dCTP 各 0.4 mmol/L，0.4 mmol/L dUTP : dTTP 不同比率的混合物，5U Tag DNA 聚合酶，5 μl 10 X PCR 缓冲液。用水加至终体积 50 μl ( 见注 1 和注 2 )。
( 3 ) 温度循环程序为 94°C 预变性 1 min；92°C 变性 30s，62°C 退火 20s，72°C 延伸 2 min，共计 25 个循环；最后 72°C 再延伸 4 min。其中将延伸时间延长至 2 min 是因为测试表明这样可以显著的提高产量（数据略去）。根据 PCR 的不同产量，需同时做 4 个或更多的 50 μl 反应体系以获得足够的产物（胶回收后应最好约为 7 μg DNA；见注 3 )。
( 4 ) 将得到的 PCR 产物合并，并通过 1% 的琼脂糖凝胶电泳分离纯化（见注 4)。如果量足够多的话，在日光下即可从胶上看到浅红色的条带。将条带切割下来后加到一两个胶回收试剂盒的离心柱中，用 50 μl 洗脱缓冲液洗脱。
( 5 ) 使用波长范围 220~350 nm 的分光光度计检测 260 nm 的基线校准吸光值，测定 PCR 回收产物的浓度。我们通常以 1 : 30 稀释后在 140 μl 的比色杯中测量。NExTDNA 混编产物最理想的得率为 7 μg DNA。更低的得率可能也行，但足够量的 DNA 可确保下一步的基因重组顺利进行（见 10.3.7 )。将所有理想的 DNA 都用于下步反应。
在这项研究中，我们均使用尿苷酸作为交换核苷酸，然而此项技术也同样适用于其他类似物的引入。例如，8- 氧化鸟嘌呤（8- oxoguanine) 可被 8-氧化鸟嘌呤 DNA 糖基化酶 FPG ( foramidopyrimidine-DNA glycosylate) 切除 [ 10 ]。该减基可用于 AT 富集区，那里 UDG 酶频繁的切割 DNA，也可用于缺少胸腺嘧啶的 GC 富集区。因此，将多种交换核苷酸结合在一起使用可以产生所需大小的片段，用于下一步的再组装。另外，在 PCR 引物中引入交换核苷酸应确保基因库中的这些区域同样被混编。
3.3 酶解反应和化学切割
将尿苷酸交换 PCR 纯化后的产物进行 UDG 酶解反应，在交换核苷酸位置切割 DNA。该酶对双链和单链 DNA 均有效，通过对双脱氧尿苷 C1' 位点的亲核攻击引发水解反应，高特异的去除尿嘧啶基团 [12] 。哌啶用于经 UDG 酶切割去除尿嘧啶后的骨架部分 [13]。通过高分辨率尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析上述切割反应的结果，其中 dUTP 的比率从 100% 到 0% 不等（图 10.1B )，进而再用图像分析软件定量（图 10.1C)。对于很小的片段，可通过引入放射性标记来更好地观测（见注 2 )。
( 1 ) UDG 酶解反应体系包括 45 μl PCR 纯化产物（含约 7 μg DNA，见 10.3.2 节步骤 4)，6 μl 10 X UDG 反应缓冲液，2 U 大肠杆菌 UDG 酶。加水至 60 μl，37°C 消化 1 h ( 见注 6 )。
( 2 ) 使用哌啶切割 DNA 反应体系包括终浓度为 10% ( m/V ) 的哌啶（60 μl 体系中加 6.7 μl 哌啶储液），在有加热盖子的热循环仪中 90°C 反应 30 min ( 见注 7)。
作为采用相对温和的反应条件的尝试，用其他的一些内切核酸酶替代哌啶切割骨架 DNA [11]，如内切核酸酶 IV [ 14 ] ，核酸外切酶 Ⅲ [15]，或 T4-内切核酸酶 V [16] 。我们检测了最后一种但否定了其使用。T4 内切核酸酶 V 切割 UDG 作用后的 DNA 结果得到的是不完全断裂，这从产物的大小分布可见（图 10.2A )。更麻烦的是这一反应必将引起高错误率的出现。应用 UDG 和 T4 内切核酸酶 V 切割 CAT 野生型基因，胶回收后进行重组装，送其中的 6 个克隆共计 3930 bp 去测序，结果突变率为 1.75%。对于这一结果我们给出了两个原因。首先，T4 内切核酸酶 V 是通过其裂解酶活性切割 DNA 骨架，其间催化了一个 β 消除反应，留下了 3' 端不饱和的醛基（4-羟基-2-戊醛）连在磷酸基团上 [ 11，17] 。进一步生成游离磷酸基的化学反应并未完成，如此产生的片段不利于聚合酶的起始。其次，通过片段比较发现，不是所有引入尿苷酸位点的骨架都完成了切割。但这些位置的尿嘧啶都被切掉了，这种碱基缺失的模板会造成错误核苷酸的引入。Miyazaki [18] 建议使用大肠杆菌内切核酸酶 V，但从提供的数据可见，切割的效率更低，即使延长切割时间（12 h) 并提高 dUTP 的比率（75% ) 仍不能获得短的片段。虽然可以设计进一步的实验解决这些问题，但因哌啶的切割即好又划算，就没有必要再做尝试。
作为哌啶的化学替代品，我们检测了氢氧化钠的效果。将哌啶储液替换为 0.5 mol/L 氢氧化钠溶液，加至 DNA 体积的 10% ( V/V ) ，90°C 反应 30 min。使用哌啶和氢氧化钠切割相同的尿苷酸交换 PCR 产物，比较二者变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后 EB 染色的结果。通过图像分析软件，得到的断裂片段的强度分布基本一致。平行进行的重组装反应也得到了相似的结果。这些都证明了哌啶引发的主要反应是碱催化的 β 消除反应，将两个余下的磷酸基从 DNA 的糖基上去除下来。因此，如果非常重视安全因素，可用氢氧化钠替代哌啶。然而我们未测序分析氢氧化钠切割片段重组装后的产物是否产生突变。原则上，哌啶更适合引发糖基上的亲核攻击，切割的效果也更为彻底。
3.4 尿素变性聚丙酰胺凝胶电泳
使用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析断裂片段的大小分布并纯化特殊大小范围的片段（见 10.3.5)。此步为备选步骤，仅对要求严格控制的断裂反应推荐使用。
( 1 ) 凝胶包含 6.7 mol/L 尿素，11%~12% 的聚丙烯酰胺和 1 X TBE 缓冲液 [8] 。分析胶的大小为 10cm X 8cm X 1mm，制备胶的大小为 10cm X 8cm X 2mm (见 10.3.5.2 )。因尿素降解会影响电泳效果，故要求所有的凝胶都新鲜制备。我们通常使用 31.5 g 尿素，29.2 ml 包含 30% 聚丙烯酰胺，0.8% 甲叉双丙烯酰胺（37.5 : 1 ) 的凝胶储液，17.1 ml 水，7.5 ml 10 X TBE 缓冲液，500 μl 10% APS 水溶液和 50 μl TEMED；这些足够在一个制胶器中同时制备 9 块分析胶（见注 8 )。
( 2 ) 电泳在 56°C 进行。我们使用 Hoefer Mighty 小型基础电泳槽（Amersham)，配接温度控制水浴锅。
( 3 ) 在 1 X TBE 缓冲液中将凝胶预电泳 10 min，电压 100V。
( 4 ) 将断裂 DNA 浓缩至 7 μl，加至 speed-vac 真空离心挥发哌啶，加 25 μl 去离子甲酰胺，在 PCR 仪中 80°C 加热 3 min ( 见注9 )。再加入 3 μl 60% 的蔗糖溶液和 7 μl 水帮助上样（见注 10)。最终上样量为 15~20 μl ( 约含 3 μg DNA ) 。
( 5 ) 寡核苷酸混合液和 100 bp DNA 标尺可作为分子质量标准（见注 11) 。至少一个标尺使用带染料的上样缓冲液。
( 6 ) 上样后 170 V 进行电泳，至标尺中的溴酚蓝距边缘还有 0.5 cm 时结束（见注 12 ) 。
( 7 ) 在 30 ml 1 μg/ml 的 EB 溶液（1 : 5000 稀释）中染色 5 min，紫外灯下观察（见注 13 ) 。
分析型凝胶电泳结果表明，断裂产生片段的大小分布具有固定的峰值，由 dUTP 所占的比率决定。如图 10.1B 所示，多个长度分布带很容易得到，包括很小的和大的片段，分别适用于短的基因和长基因簇的混编。这样的测试只用于最初确定合适的 dUTP 比率以获得目标的片段大小分布。最后确定测试库中 dUTP 使用的最佳比率为 33.3%，且结果的重复性很好。因此，在接下来的定向进化实验中，此步分析电泳可以省略。
3.5 片段纯化
经酶解和化学裂解得到的基因片段（见 10.3.3 ) 即可通过硅胶树脂直接从切割反应液中纯化（见 10.3. 5.1)，也可通过制备型尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化（见 10.3.5.2) 。
最初我们认为如想得到特定大小的片段必须通过凝胶电泳来纯化，以确保在重组装反应中没有较长片段甚或全长片段的参杂，以免影响碰撞概率。而实际上，如不经多轮的重组装反应，就无法从纯化的片段中直接扩增出全长产物，这表明切割反应进行的十分彻底（见 10.3.7) 。因此，只有对片段大小范围有十分严格的要求时才有必要 使用凝胶电泳纯化。
3.5.1 哌啶切割后直接纯化
( 1 ) 最简便的片段纯化方法就是使用 Qiaex II 试剂盒（Qiagen) 从哌啶切割后的反应液中直接纯化（见 10.3.3)。依据该试剂盒指南进行操作（见注 14)，加入结合缓冲液后中和（约 20 μl 3 mol/L 乙酸缓冲液）。
( 2 ) 清洗两次后，分两步加入 25 μl 洗脱缓冲液洗脱。将两次洗脱液混合。
( 3 ) 离心两次，每次换一个干净的离心管（见注 15)。
3.5.2 尿素变性聚丙烯酰胺凝肢电泳纯化
注意此步为可选步骤。尝试了两种方法从凝胶中回收片段。一种是经典的水提取后乙酸/镁离子沉淀法，另一种是使用 Qiagen 公司的 Qiaex II 试剂盒。但通过染色检测提取完基因后的凝胶，发现两者都存在提取不完全的问题。
( 1 ) 经制备型尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后（见 10.3.4，步骤 1 ) ，在低强度紫外灯照射下将目标大小的条带切割下来（图 10.2B)。放入离心管中充分捣碎后加入提取缓冲液（QiaexII 提取，步骤 2 ) 或 1 ml 水（水提取，步骤 3 )，放入热混合器（Eppendorf ) 中以 37°C，1000 r/min 过夜孵育。
( 2 ) 如果使用 QiaexII 提取缓冲液提取，见 10.3.5.1 节。
( 3 ) 如使用水提取，加 1/10 体积的乙酸缓冲液，1/100 体积的氯化镁和 1 体积的异丙醇沉淀 DNA；-20°C 反应 1 h；4°C 20000 g 离心 15 min；将沉淀重悬在 50 μl 90% 乙醇中，放入热混合器中 37°C，1000 r/min 反应 1 h；-20°C 放置 1 h；4°C 20000 g 离心 15 mm；将沉淀在空气中晾干后，加入 30 μl 加入洗脱缓冲液，37°C，1000 r/min 孵育 1 h。
为得到胶提取步骤的交叉率，我们设计了 3 个母本克隆（CAT_Nd10 突变体）的混编检测实验。其中两个克隆在 100 bp 范围内包含 1 个特异的突变，另一个在 100 bp 范围内包含 2 个特异突变。混编并经 Tag 酶扩增后挑选 8 个克隆测序，结果表明其中的 6 个克隆在 100 bp 范围内有一个交叉。这与直接快速纯化得到的交叉率可比 （ 见 10.3. 5.1 和 10.3.8 )。实验共测序了 3851 个碱基，发现了 12 处错误，突变率为 0.31%。这样的错误率比快速纯化的错误率高很多，可能是由于 UV 照射（哪怕是弱的 366 nm 的光源）或是凝胶中的化学修饰引起的。因此我们在最终的 NExT DNA 混编方法中，去掉了凝胶纯化的步骤，因为额外的工作并未带来益处，反而损失了产量，提高了错误率。
3.6 纯化片段的定量
为了分析和比较纯化得到的 DNA 的产量，我们首先使用 SYBR Greenn 试剂来定量。因为 NExT DNA 混编方法的重复率很髙，我们只定量一次即可（见注 16 )。通常我们都能获得浓度为 40~60 ng/μl 的 DNA 片段。
( 1 ) 取 2 μl 纯化的 DNA 片段（见 10.3.4)，加入 50 μl 1 : 5000 稀释的 SYBR GreenII 溶液染色，此染色液对单链 DNA 非常敏感（见注 17) 。
( 2 ) 在暗箱中反应 5 min 后检测荧光信号（我们使用 96 孔的 Perkin Elmer LS 50B 荧光粉光光度计；见注 18)。染料的激发波长是 480 nm，可在 515 nm 检测发射值。
( 3 ) 使用片段大小范围内的标准寡核苷酸，稀释不同的倍数绘制浓度标准曲线，标定片段所含 DNA 的浓度。
3.7 基因重组装和扩增
通过内部引物延伸反应从纯化的基因片段重组得到全长基因（见 10.3. 5)，其 间不断提高退火温度并最好使用具有校正功能的 DNA 聚合酶，如 Vent ( 图 10.3)。在内部引物延伸 PCR 过程中，片段之间可相互作为引物，因此每个循环反应后都会加长，直到最终得到全长基因。最后，通过常规 PCR 反应，加入两个末端引物对组装反应的产物进行扩增，构建克隆送测序。在方法建立过程中，通过琼脂糖凝胶电泳不断检测重组装反应结果（图 10.3 )。重组装反应在进行若干轮后停止，所得产物在此基础上进行 PCR 扩增。最后一步反应的基本原理与其他的基因组装进程相同，但有很重要的改变。尽管经历了剧烈的化学切割条件，使用了高保真 DNA 聚合酶的组装反应仍很高效。
( 1 ) 取出约 2 μg 的纯化 DNA 片段（见 10.3.5 ) 进行重组装。事实上如使用 Vent 聚合酶，少于 1 μg 的 DNA 片段都够用。通常我们都使用 20~25 μl 的片段溶液，无须检测浓度。
( 2 ) 在 DNA 片段中加入 4 μl ( 见注 19 ) 10 mmol/L 的 dATP、dTTP、d CTP 和 dGTP 的混合物（终浓度 800 μmol/L ) ，以及 4 U Vent DNA 聚合酶（NEB)，1~4 μl 25 mmol/L 的硫酸镁，5 μl 的 10X 反应缓冲液，加水定溶至 50 μl 。
( 3 ) 循环反应为 94°C 3 min；92°C 变性 30s，30°C 退火 60s，每轮增加 1°C ( 冷却率 1°C/s)，72°C 延伸 1 min，每轮多加 4s，共进 36 个循环；最终 72°C 再延伸 3 min。
( 4 ) 取重组装产物 10 μl ( 见注 20 ) 使用基因的合适引物（25 pmol 引物，0.2 mmo/L dNTP，25 个循环，40s 的延伸时间），进行常规 PCR 反应。
( 5 ) 使用适当的限制性酶切位点将扩增的基因克隆到载体上。
据我们所知，大多数已发表的片段重组装过程都使用 Taq 酶。Vent DNA 聚合酶的 3'→5' 校对核酸外切酶活性是基于其仅在 3' 端移除合成链上错配的核苷酸，直到聚合反应可以从退火的末端开始。这意味着核苷酸链上的点突变，即便是紧邻 3' 端的位置，都不会有问题 [19] 。为了比较这两种聚合酶的作用，分别使用 Tag 和 Vent 酶平行进行两组重组装实验，均使用相同的片段库作为起始。适量的重组装产物作为扩增 PCR 的模板，当使用 Taq 酶时，产物经琼脂糖凝胶电泳只有一条带，然后通过图像分析定量。结果，使用 Vent 酶的得到 DNA 产量为 Taq 酶的 35 倍。有意思的是，将使用 Tag 酶得到的 6988 个碱基测序，发现只有 5 个额外的突变（0.075% ) 。因此，在现有序列的统计误差内，使用 Tag 和 Vent 酶进行 NExT DNA 混编产生的错误率基本是相同的（见 10.3.8 )。关于两者产量的显著差别，可用校正酶的性质来解释。以 Vent 酶为例，该酶具有链置换活性 [ 20 ] ，这可能会帮助许多杂交反应的进行，另外 Vent 酶在 95°C 的半衰期约为 8 h，相对于 Tag 酶的 1.6 h [ 20 ] ，更适合长时间的重组装反应。另外，Taq 酶习惯在 3' 端多加额外的 dATP [21] ，这也是妨碍重组装反应进行的可能原因。除了上述因素，还发现 Tag 酶虽然适合片段的重组装反应，但其重组装的产物作为下一步扩增反应的模板，很难使用具有校正功能的 DNA 聚合酶进行扩增。
3.8 交叉率、片段的平均长度及突变率分析
将上面描述的 NExT DNA 混编技术应用在 600 bp 长的 CAT 基因的定向进化研究中，其中 N 端和 C 端分别截短 10 个和 9 个氨基酸残基（CAT_Nd10_Cd 9 ) 。实验中，挑选 12~383 碱基间具有不同突变模式的 5 个克隆与一个用于回交的截短野生型克隆相混合作为固定库，进行 33.3% 尿苷酸交换 PCR 来混编。从溶液中直接纯化片 段（见 10. 3.5.1 ) ，再经 Vent 聚合酶进行重组装反应（见 10.3.7 节）。在没有抗性选择压力的对照平板中挑选 8 个混编克隆进行测序（图 10.4A ) 。这些克隆独特的突变模式显示所有被检测的克隆都是从 2 ( 如克隆 1 ) ~4 个（如克隆 4 ) 母本克隆演化来的。在所涉及的 372 bp 的片段中，每 93~186 bp 就有一个交叉，平均片段长度为 114 bp。
通过测序结果计算突变率。在所测的 4425 个碱基中，发现了 4 个突变（一个 A 变为 G，一个 T 变为 C，1 bp 的插入和 1 bp 的缺失），计算突变率为 0.09%。这比之前报道的 DNA 酶混编的错误率 0.7% 要低得多。如 10.3.7 节中所述，并不是只有 Vent 聚合酶才能达到如此低的突变率。因为我们得到的片段大小分布和交叉率均与 DNA 酶混编的实验结果相当，因此分析前面报道的高错误率可能是由 DNA 酶解及凝胶观测时的紫外损伤引起的，而与片段大小和聚合酶种类无关。低突变率对长片段 DNA 的混编尤为重要，因为我们要尽可能地避免将功能异常的或不需要的分子引入基因库中。
进一步的实验中，挑选 4 个截短 CAT 基因（CAT_ Cd26 ) 母本进行了上述相同的混编实验，它们均包含一个突变，分布在 9~575 碱基，最终挑选 5 个克隆测序（图 10. 4B)。可检测的片段平均长度为 86 bp，其中包括许多短的片段。在 “对照 5”克隆中，突变位置分别相隔仅 6 个碱基（324 和 330 位置），12 个碱基（364 和 376 位置） 及 11 个碱基（404 和 415 位置）的突变体都被分开。这次实验得到片段的平均长度比之前的实验要小，这是因为更多的突变利于片段长度的检测。至于许多短片段的获得可能原因有两点：使用的 QiaexII 试剂盒可高效的回收短片段 DNA，或者基因扩增时的交叉是一个复杂的过程，包含如 PCR 基础上的链交换。
3.9 NEXT 片段断裂—预测程序
因为 dUTP 的掺入及产生的片段断裂都基于可推导的原则，我们开发了名为 NExTProg 的计算程序。该程序可预测双链 DNA 的 NExT 断裂模式，使得研究人员不需要实验就可设计合适的 dUTP: dTTP 比率。该程序通过读入 DNA 序列文件和 dUTP: dTTP 比值，就可算出所有可能的片段、它们出现的可能性及相对分布。给定 DNA 的互补链由程序自动生成并加入计算。计算后的结果以柱型统计图表形式显示，所有数据都可以列表形式输出以备使用（图 10. 5A ) 。当需要设定片段大小的上下限时（如凝胶纯化所需），程序可计算材料损失的可能性并调整每个片段的相对分布值。
3.9.1 数学原理
( 1 ) 设定给定 DNA 序列中的一个胸腺嘧啶被尿嘧啶替代的概率为 p。
( 2 ) 当两个胸腺嘧啶都被尿嘧啶替代时，就生成两者之间的片段，其概率为 p X p。
( 3 ) 只有当上述两个胸腺嘧啶间的 n 个胸腺嘧啶都不被替代时，片段才能存在，得到的概率为 p X p X ( 1-p）n。
( 4 ) 对于包含 1 个或 2 个 DNA 末端的片段，p X p 概率中的 1 个或 2 个 p 设为 1 ( 见注21)。
( 5 ) 为比较断裂结果，我们定义片段概率为除以所有值的和。
我们的计算方法与先前的计算都不同 [23]，因为我们考虑到片段的两个末端都需要产生，但不考虑诸如序列偏倚性和不确定的酶解条件等问题，这些会严重阻碍对 DNA 酶酶解的计算。
对于包含 x 个尿苷酸的基因，最多可产生可能片段 [ 根据高斯定理，当 x 为奇数时，等于（ x + 1 ) X （x + 2 ) / 2；见注 22 ]。因此，对于一个典型的包含 250 个胸腺嘧啶和 240 个腺嘌呤（在互补链中也计算为胸腺嘧啶）1000 bp 长的基因，很快程序计算产生 31626 + 29161 = 60787 个片段，包括它们的概率和序列。
因为大多数用户可能都对结果概貌感兴趣，该程序将所有具有相同大小的片段汇集在一起，将它们的概率加和，给出占所有概率加和的百分比对长度的分布，在程序中以 “％mol ”表示。为了将电泳条带可视化，通过某一片段的概率乘以其长度计算 “mass”分布。这些值被均一化，代表碱基比率，定义为 “ mass”，如在碱基对中固定长度，程序中显示为“ ％mass ”。片段序列的输出文件按出现可能性由大到小列出了所有的片段。同样的序列只列出一次，概率为它们的加和。
3.9.2 程序的校准及与实验结果的对比
在比较测量和计算的结果之前，有一个非常重要的值要考虑：就是交换 PCR 时聚合酶掺入尿苷酸对胸苷酸的比率。这个值可能不仅取决于 dUTP : dTTP 的值，也取决于使用的聚合酶类型、核苷酸的绝对浓度以及使用的缓冲液。因此当使用程序时，需要设定该值。尿苷酸的掺入量可用下列方法测量：直接的方法是通过放射性标记的 dUTP，计算 PCR 产物的放射能；间接的方法是定量分析断裂图谱。我们选择后者，因为它同时提供了与我们的软件相似的基本原则。但需要注意这种对资料的双重利用只有在断裂完全的情况下才有效。
为定量分析裂解实验，我们使用常用的条件（标准 Tag 聚合酶 [ 24 ] ，200 μmol/L dNTPs)。
( 1 ) 在尿苷酸交换 PCR 反应中（见 10.3.2，见注 2 ) ，使用 32P-dCTP 标记的 DNA。
( 2 ) 进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（见 10.3.4 ) 。
( 3 ) 通过成像仪对凝胶进行放射能成像（见注 23)。这避免了因小片段的低效染色造成的信号变形。
( 4 ) 将每条带都通过图像分析软件，如 QuantityOne ( BioRad ) 或 NIH Image/Scion Image/imagej ) 生成线密度曲线。
( 5 ) 从线密度曲线中计算出片段和放射标记的分子质量标准的相对迁移值。
( 6 ) 将代表标记物相对距离和长度的可变参数 a 和 b 代入方程：相对距离 = a X In (碱基对长度）+ b 。
( 7 ) 用上述公式将片段的相对距离值换算为核苷酸长度。
( 8 ) 通过结合整数的核苷酸长度值和将相应的强度信号平均化，将强度信号/连续长度分布转换为强度信号/整数（只列出分散的寡核苷酸长度）。
( 9 ) 通过将每个单独的强度除以强度总和，将分布均一化。
上述变性胶的放射能成像图见图 10.5B。强度均一化后表示为 “％mass”（ 见图 10.50。将这一实验与程序计算结果相比较确定的尿苷酸对胸苷酸的相对掺入值。程序计算中，设置的掺入值为 0.2~0.3，按 0.01 增长。当设置值为 0.26 时，实验和计算结果最为吻合，其中根据测量和均方根分析预测的片段大小范围为 10~150 个碱基， 而计算得到的可靠片段长度为 4~200 个碱基（图 10.50。当使用分子质量标准的范围时（20~100 个碱基），因子最佳的设置值为 0.25。很显然这些图谱重叠得很好，并且电泳条带中的峰和点都可以很好地解释（图 10.5B、图 10.50。重要的是，y 轴的值落在了不需进一步调整的位置。我们确信尿苷酸的掺入率是确定的，并且没有不完全断裂造成的影响，因为实验和计算得到的结果几乎一模一样，并且尝试了许多实验条件检测断裂情况。使 用 33.3% U 断裂的放射活性测量值与计算值也吻合得很好 。但使用 25% U 断裂的放射活性检测结果中产生了相当量的大于 100 bp 标准的片段，并且出现了一些因标尺问题引起的偏离。然而同样使用掺入率 0.26，与使用 EB 染色后的断裂结果相比较，考虑到凝胶染色的长度依赖性，结果十分吻合（图 10.5D ) ，其中 EB 染色因有合适的分子质量标准，对于较长片段更为准确。因为针对放射活性检测和 EB 染色的尿苷酸掺入 PCR 分别使用了不同的缓冲液（见 10.2.2)，多种 PCR 增强剂，如硫酸铵、吐温- 20 或 Triton X-100 的加入 对 dUTP 对 dTTP 的掺入率并没有显著的影响。
来源：丁香实验
