利用核苷酸交换和剪切技术进行DNA碎裂和定向进化
丁香园
3280
1. 简介
近年来，化学、制药和食品加工等行业对“特性酶”（tailor-made enzyme) 的需求越来越多。因为关于蛋白质的折叠、相互作用及如何稳定都并未完全研究清楚，到现在设计特性蛋白的途径仍然很复杂，并且要求耗时的多轮的设计和检验。采用重复进行突变、筛选和混编的进化步骤是获得目标特性的快速有效的手段，即使蛋白质结构 特征并不知晓。
多种方法可用于基因库的体外重组 [1] 。然而使用起来无一不是有缺陷或是有困难的。例如，发展的非常成熟的Stemmer 方法，通过优化酶切条件，使用 DNA 酶切割 DNA 获取所需大小的片段为进一步筛选大小合适的片段，通过琼脂糖凝胶电泳纯化酶切片段，再经内部引物延伸反应再组装，最后使用常规 PCR 扩增。然而，精确 控制 DNA 酶的酶切条件，如使用的酶及 DNA 的量、反应时间及温度等非常复杂，需要精细的优化摸索。其他的一些方法，如交错延伸程序（staggered extension process， StEP [ 4 ] ) 和随机引物法（randompriming )[ 5 ] 都受 DNA 组成的限制，并且由于缺少对重组及产生片段大小范围的控制而更为复杂难辨。因此欲使用上述的方法得到理想的结果都需要非常缜密的优化筛选。
不同于上述的方法，我们设计了一种高效、稳定的新方法。核苷酸交换和剪切技术 （NExT) 进行 DNA 混编是以 “交换核苷酸”的随机引入为基础。这些交换核苷酸在 DNA 序列中的出现和位置就指明了其产生的裂解部位，不需要进一步的调整。
应用 NExT 方法提高氯霉素乙酰转移酶 I ( CAT，可产生对氯霉素的抗性）截短突变体功能的研究对 NExT 方法进行了很好的发展和检验。在基因水平上对四组截短突变体独立开展定向进化实验。第一组 CAT 突变体库为 N 端截短 10 个氨基酸残基 ( CAT _Nd10 )，第二组突变体库为 C 端截短 9 个氨基酸残基（CAT _Cd9 )，第三组为 C 端截短 26 个氨基酸残基（CAT_ Cd26)，第四组为 N 端和 C 端分别截短 10 个和 9 个氨基酸残基（CAT_ Nd10_Cd9 )。从易错 PCR ( error-prone PCR) 多样化步骤中挑选 3~6 个产物作为检测库可以获得 NExT DNA 混编的详细数据 [6] 。
CAT_ Nd10 可以在含有 25 μg/ml 氯霉素的平板上生长，而 CAT_Cd9 则根本不生长。应用基于易错 PCR 和 NExT DNA 混编的完整定向进化策略提高二者的酶活性。通过优化，二个库均有若干克隆可在含有 400 μg/ml 氯霉素的平板上生长（未检测更高的浓度），证明了此种技术的有效性。同时，这种优化的方法也应用于根据我们的计算程序选出的含 30% dUTP 的 TEM-1 型 β-内酰胺酶（见 10.3.9)。这种裂解和再组装在实验的第一步就引入，只需确保足够的起始材料，节省了全部的前导和中间检测以及分析步骤（数据略去）。
本章概述了优化的 NExT 混编方法的全部步骤，从克隆开始（见 10.3.1)，到尿苷酸交换 PCR ( 见 10.3.2 )，酶解反应及化学剪切（见 10.3.3 )，片段纯化（见 10.3.5)，及最终的再组装和扩增（见 10.3.7)。对各步骤可调整的部分也分别进行了讨论。同时，给出了关于混编过程详细特性的分析方法（见 10.3.4 和 10.3.6 )，比较了不同方法的交换率、平均片段长度和变异率（见 10.3.8)。最后，介绍了一种预测 NExT 断裂参数和结果的计算程序（见 10.3.9 )。
NExT 方法基于预先确定的合理的 dUTP : dTTP 的比率，操作简单，因此非常适于短的基因片段和大的基因组合的混编。由于 NExT 混编方法的稳定和简便性，就算之前很少涉及这个领域的工作者也能应用此方法解决 DNA 和蛋白质水平上的生物化学领域的问题。
2. 材料
2.1 克隆
( 1 ) 切割目标基因和质粒的合适的限制性内切核酸酶。这里使用 Xba I 和 Hind III。
( 2 ) T4 DNA 连接酶（不同厂家）。
( 3 ) 感受态细胞（大肠杆菌 RV 308 和 XL-1)。
( 4 ) 质粒载体 pLisc- SAFH 11[7] 。
2.2 尿苷酸交换 PCR
( 1 ) 5' 和 3' 引物各 1 条，满足基因扩增需要，并且包含克隆位点。
( 2 ) 标准 Taq 聚合酶（不同厂家）。
( 3 ) 10X PCR 缓冲液（不同厂家），如 160 mmol/L 硫酸铵，670 mmol/L Tris-氯化氢（25°C 时 pH 8.8 )，15 mmol/L 氯化镁和 0.1% 的吐温-20；或者 100 mmol/L Tris 氯化氢（25°C 时 pH 9.0 )，500 mmol/L 氯化钠，15 mmol/L 氯化镁和 1% 的 Triton X-100。
( 4 ) 混合 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 和 dUTP 的 dNTP 储液（10 mmol/L 或 100 mmol/L；不同厂家）。
( 5 ) 灭菌去离子水。
( 6 ) 10X Tris-硼酸-EDTA 缓冲液（TBE 缓冲液）：包含 1 mol/L Tris、0.83 mol/L 硼酸和 1 mmol/L EDTA。
( 7 ) 溴化乙锭（EB) 溶液：5 mg/ml EB 水溶液。
( 8 ) 1% 的琼脂糖凝胶：1% ( m/V ) 的琼脂糖溶解在 0.5 X TBE 缓冲液中。加热至琼脂糖完全溶解。倒胶前加入 TB ( 1 : 10000 稀释)。在 0.5X TBE 缓冲液中电泳。
( 9 ) 胶回收试剂盒（GE 或 Qiagen 公司）。
( 10 ) PCR 回收试剂盒（GE 或 Qiagen 公司）。
2.3 酶解反应和化学切割
( 1 ) 大肠杆菌尿嘧啶-DNA-糖基化酶（UDG) ( NEB 或 PeqlabbiotechnologieGmbH 公司）。
( 2 ) 99.9% 的哌啶（Sigma 公司）。
2.4 尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
( 1 ) 尿素（纯度 > 99.5%)。
( 2 ) 30% 聚丙烯酰胺，0.8% 甲叉双丙烯酰胺（37.5 : 1 ) 储液（Carl Roth GmbH 公司）。
( 3 ) 10 X TBE 缓冲液（见 10.2.2.6)。
( 4 ) 10% 过硫酸铵（APS) 水溶液。
( 5 ) 四甲基二乙胺（TEMED)。
( 6 ) 去离子甲酰胺。
( 7 ) 固定分子质量大小的寡核苷酸，作为分子质量标准或短距离 DNA 标尺，如 100 个碱基梯度标尺（NEB 公司）。
( 8 ) 6X 溴酚蓝上样缓冲液：70% (m/V) 的蔗糖溶液中加 0.25% (m/V) 的溴酚蓝。
( 9 ) 溴化乙锭溶液：5 mg/ml EB 水溶液。
2.5 片段纯化
2.5.1 哌啶切割后的直接纯化
( 1 ) QiaexII 试剂盒（Qiagen 公司）。
( 2 ) 乙酸缓冲液：3 mol/L 乙酸钠溶液，pH 5.3。
( 3 ) 洗脱缓冲液：10 mmol/L Tris-氯化氢，pH 8.0。
2.5.2 通过尿素变性聚丙烯酰胺凝肢电泳纯化
( 1 ) QiaexII 纯化：扩散缓冲液：0.5 mol/L 乙酸铵，10 mmol/L 乙酸镁，1 mmol/L EDTA，0.1% 十二烷基硫酸钠 （SDS)，pH 8.0。
( 2 ) 提取水溶液：灭菌去离子水。
( 3 ) 乙酸缓冲液：3 mol/L 乙酸钠溶液，pH 5.3。
( 4 ) 1 mol/L 氯化镁。
( 5 ) 异丙醇。
( 6 ) 90% 乙醇。
( 7 ) 洗脱缓冲液：10 mmol/L Tris-氯化氢，pH 8.0。
2.6 纯化片段的定量
1 : 5000 稀释的 SYBR 绿色荧光染料 II ( 分子探针）。
2.7 基因重组装和扩增
( 1 ) 10 mmol/L dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP 的混合物。
( 2 ) Vent DNA 聚合酶（NEB 公司）。
( 3 ) 25 mmol/L 硫酸镁。
( 4 ) Tag DNA 聚合酶（不同厂家）。
4. 注
1. 尽管 NexT DNA 混编方法的整体错误率已经很低，尿苷酸交换 PCR 中仍然推荐使用高保真聚合酶。但是，须谨慎选择该聚合酶的种类以使其能够有效地掺入尿苷而不是在模板的尿苷酸位点停滞。Vent exo+ (NEB) 以及非尿苷酸停滞突变体的 pfu 聚合酶（Stratagene) 都被报道可以掺入尿苷。
2. 很小的碎片能够被放射性同位素标记显示。这种情况下，加入 0.5 μl 的 3.3 μmol/L 32P-dCTP 溶液（约 0.5 μCi) 到尿苷交换 PCR 混合物。对于放射性实验，使用 PCR 清洁试剂盒之前不用经过琼脂凝胶电泳步骤（见 10.3.2.4 )，因为非放射性模板不影响放射性片段的显示。
3. 由于热循环仪最适工作体积的限定，我们用了 4 个 50 μl 试管的尿苷交换 PCR 反应。
4. 需要分离含有尿嘧啶的产物及不含尿嘧啶的模板，以确保没有模板被保留到下—步。
5. 我们更倾向于利用两个柱层析进行平行实验以节省时间。这样，我们在两个试管中分别进行尿苷交换 PCR ( 见 10.3.3 ) 的酶及化学切割实验以保证我们的热循环仪在合适的工作体积内。样品可以在 10.3. 5.1 第二步或者 10.3.4 第四步组合起来进行片段纯化。
6. 酶解 2 h 或者更长时间产生同样结果，表示酶解过程的选择性及一致性。
7. 哌啶有毒，需要在通风厨中操作。所有其他含有哌啶的溶液，如 Qiaex II 试剂盒中（见 10.3. 5.1 ) 用过的俘获缓冲液，需要谨慎处理，弃于密闭试管中。
8. 我们制备的凝胶最多用 3 d。加入的尿素粉末影响体积，需要被考虑到终浓度中。体积为 9 块凝胶的溶液被用于制备 8 块凝胶。
9. 哌啶影响片段的电泳性质，因此，应该尽最大可能使其挥发。
10. 对于放射性实验，仅仅使用 7μl DNA-甲酰胺样品，补充加入 3 μl 60% 的蔗糖溶液和 7 μl H2O；混匀后取 15 μl 样品加入凝胶中。
11. 对于放射性实验，寡核苷酸和 DNA 分子质量梯度被 32P-γATP 磷酸化，然后用分子筛纯化去除多余的 32P-γATP。我们利用 SephadexG-50 柱料，但是任何其他核酸去除试剂盒都适用。
12. 为避免染料与 DNA 片段叠合，我们只是在分子标记中用了溴酚蓝而没有在样品中用。
13. 染色孵育时间不要超过 5 min，否则较小的片段会开始从凝胶中跑出。因此，用 SYBR green II 染色比较困难，因为这种染剂染色需要孵育 5~10 min。请注意尿素凝胶在紫外光下很快变白。
14. 我们发现，对于避免损失小片段，QiaexII 试剂盒是最适用的。尽管厂家推荐使用的 DNA 片段范围是大于 40 个碱基，我们发现此试剂盒可以很好地回收大约 20 个碱基的片段。
15. 由于试剂盒基质会结合 DNA 从而影响重组装反应，因此离心两次来确保 DNA 片段不会被微量的基质材料污染是很必要的。
16. —般来说，如果我们开始就用 7 μg 或更多的尿苷交换 PCR 反应产物进行实验，就不必检测 DNA 片段的浓度。
17. 供应商推荐使用 1: 10000 的稀释倍数，我们发现对于小的和低浓度的 DNA 片段 1:5000 的稀释效果更好。
18. 最好使用白色的 96 孔 SBS 板，因为白色板会增强荧光。
19. 我们选用了较高量的 dNTP，因为在长达 4 h 的重组装反应中 dNTP 可能降解。
20. 选择此体积以确保多样性。
21. 基因中尿苷掺入的所有可能类型的总和是 1，但是所有片段的概率总和要大一些，因为每种类型可以产生好几种片段。
22. 这个计算包括长度为零碱基的片段，当两个尿嘧啶紧挨在一起时会产生这种情况。
23. 同位素放射自显影的胶可应用 X 射线光片显影。但是，现代化影像设备可以给出更大的线性测量范围。
参考文献
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多种方法可用于基因库的体外重组 [1] 。然而使用起来无一不是有缺陷或是有困难的。例如，发展的非常成熟的Stemmer 方法，通过优化酶切条件，使用 DNA 酶切割 DNA 获取所需大小的片段为进一步筛选大小合适的片段，通过琼脂糖凝胶电泳纯化酶切片段，再经内部引物延伸反应再组装，最后使用常规 PCR 扩增。然而，精确 控制 DNA 酶的酶切条件，如使用的酶及 DNA 的量、反应时间及温度等非常复杂，需要精细的优化摸索。其他的一些方法，如交错延伸程序（staggered extension process， StEP [ 4 ] ) 和随机引物法（randompriming )[ 5 ] 都受 DNA 组成的限制，并且由于缺少对重组及产生片段大小范围的控制而更为复杂难辨。因此欲使用上述的方法得到理想的结果都需要非常缜密的优化筛选。
不同于上述的方法，我们设计了一种高效、稳定的新方法。核苷酸交换和剪切技术 （NExT) 进行 DNA 混编是以 “交换核苷酸”的随机引入为基础。这些交换核苷酸在 DNA 序列中的出现和位置就指明了其产生的裂解部位，不需要进一步的调整。
应用 NExT 方法提高氯霉素乙酰转移酶 I ( CAT，可产生对氯霉素的抗性）截短突变体功能的研究对 NExT 方法进行了很好的发展和检验。在基因水平上对四组截短突变体独立开展定向进化实验。第一组 CAT 突变体库为 N 端截短 10 个氨基酸残基 ( CAT _Nd10 )，第二组突变体库为 C 端截短 9 个氨基酸残基（CAT _Cd9 )，第三组为 C 端截短 26 个氨基酸残基（CAT_ Cd26)，第四组为 N 端和 C 端分别截短 10 个和 9 个氨基酸残基（CAT_ Nd10_Cd9 )。从易错 PCR ( error-prone PCR) 多样化步骤中挑选 3~6 个产物作为检测库可以获得 NExT DNA 混编的详细数据 [6] 。
CAT_ Nd10 可以在含有 25 μg/ml 氯霉素的平板上生长，而 CAT_Cd9 则根本不生长。应用基于易错 PCR 和 NExT DNA 混编的完整定向进化策略提高二者的酶活性。通过优化，二个库均有若干克隆可在含有 400 μg/ml 氯霉素的平板上生长（未检测更高的浓度），证明了此种技术的有效性。同时，这种优化的方法也应用于根据我们的计算程序选出的含 30% dUTP 的 TEM-1 型 β-内酰胺酶（见 10.3.9)。这种裂解和再组装在实验的第一步就引入，只需确保足够的起始材料，节省了全部的前导和中间检测以及分析步骤（数据略去）。
本章概述了优化的 NExT 混编方法的全部步骤，从克隆开始（见 10.3.1)，到尿苷酸交换 PCR ( 见 10.3.2 )，酶解反应及化学剪切（见 10.3.3 )，片段纯化（见 10.3.5)，及最终的再组装和扩增（见 10.3.7)。对各步骤可调整的部分也分别进行了讨论。同时，给出了关于混编过程详细特性的分析方法（见 10.3.4 和 10.3.6 )，比较了不同方法的交换率、平均片段长度和变异率（见 10.3.8)。最后，介绍了一种预测 NExT 断裂参数和结果的计算程序（见 10.3.9 )。
NExT 方法基于预先确定的合理的 dUTP : dTTP 的比率，操作简单，因此非常适于短的基因片段和大的基因组合的混编。由于 NExT 混编方法的稳定和简便性，就算之前很少涉及这个领域的工作者也能应用此方法解决 DNA 和蛋白质水平上的生物化学领域的问题。
2. 材料
2.1 克隆
( 1 ) 切割目标基因和质粒的合适的限制性内切核酸酶。这里使用 Xba I 和 Hind III。
( 2 ) T4 DNA 连接酶（不同厂家）。
( 3 ) 感受态细胞（大肠杆菌 RV 308 和 XL-1)。
( 4 ) 质粒载体 pLisc- SAFH 11[7] 。
2.2 尿苷酸交换 PCR
( 1 ) 5' 和 3' 引物各 1 条，满足基因扩增需要，并且包含克隆位点。
( 2 ) 标准 Taq 聚合酶（不同厂家）。
( 3 ) 10X PCR 缓冲液（不同厂家），如 160 mmol/L 硫酸铵，670 mmol/L Tris-氯化氢（25°C 时 pH 8.8 )，15 mmol/L 氯化镁和 0.1% 的吐温-20；或者 100 mmol/L Tris 氯化氢（25°C 时 pH 9.0 )，500 mmol/L 氯化钠，15 mmol/L 氯化镁和 1% 的 Triton X-100。
( 4 ) 混合 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 和 dUTP 的 dNTP 储液（10 mmol/L 或 100 mmol/L；不同厂家）。
( 5 ) 灭菌去离子水。
( 6 ) 10X Tris-硼酸-EDTA 缓冲液（TBE 缓冲液）：包含 1 mol/L Tris、0.83 mol/L 硼酸和 1 mmol/L EDTA。
( 7 ) 溴化乙锭（EB) 溶液：5 mg/ml EB 水溶液。
( 8 ) 1% 的琼脂糖凝胶：1% ( m/V ) 的琼脂糖溶解在 0.5 X TBE 缓冲液中。加热至琼脂糖完全溶解。倒胶前加入 TB ( 1 : 10000 稀释)。在 0.5X TBE 缓冲液中电泳。
( 9 ) 胶回收试剂盒（GE 或 Qiagen 公司）。
( 10 ) PCR 回收试剂盒（GE 或 Qiagen 公司）。
2.3 酶解反应和化学切割
( 1 ) 大肠杆菌尿嘧啶-DNA-糖基化酶（UDG) ( NEB 或 PeqlabbiotechnologieGmbH 公司）。
( 2 ) 99.9% 的哌啶（Sigma 公司）。
2.4 尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
( 1 ) 尿素（纯度 > 99.5%)。
( 2 ) 30% 聚丙烯酰胺，0.8% 甲叉双丙烯酰胺（37.5 : 1 ) 储液（Carl Roth GmbH 公司）。
( 3 ) 10 X TBE 缓冲液（见 10.2.2.6)。
( 4 ) 10% 过硫酸铵（APS) 水溶液。
( 5 ) 四甲基二乙胺（TEMED)。
( 6 ) 去离子甲酰胺。
( 7 ) 固定分子质量大小的寡核苷酸，作为分子质量标准或短距离 DNA 标尺，如 100 个碱基梯度标尺（NEB 公司）。
( 8 ) 6X 溴酚蓝上样缓冲液：70% (m/V) 的蔗糖溶液中加 0.25% (m/V) 的溴酚蓝。
( 9 ) 溴化乙锭溶液：5 mg/ml EB 水溶液。
2.5 片段纯化
2.5.1 哌啶切割后的直接纯化
( 1 ) QiaexII 试剂盒（Qiagen 公司）。
( 2 ) 乙酸缓冲液：3 mol/L 乙酸钠溶液，pH 5.3。
( 3 ) 洗脱缓冲液：10 mmol/L Tris-氯化氢，pH 8.0。
2.5.2 通过尿素变性聚丙烯酰胺凝肢电泳纯化
( 1 ) QiaexII 纯化：扩散缓冲液：0.5 mol/L 乙酸铵，10 mmol/L 乙酸镁，1 mmol/L EDTA，0.1% 十二烷基硫酸钠 （SDS)，pH 8.0。
( 2 ) 提取水溶液：灭菌去离子水。
( 3 ) 乙酸缓冲液：3 mol/L 乙酸钠溶液，pH 5.3。
( 4 ) 1 mol/L 氯化镁。
( 5 ) 异丙醇。
( 6 ) 90% 乙醇。
( 7 ) 洗脱缓冲液：10 mmol/L Tris-氯化氢，pH 8.0。
2.6 纯化片段的定量
1 : 5000 稀释的 SYBR 绿色荧光染料 II ( 分子探针）。
2.7 基因重组装和扩增
( 1 ) 10 mmol/L dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP 的混合物。
( 2 ) Vent DNA 聚合酶（NEB 公司）。
( 3 ) 25 mmol/L 硫酸镁。
( 4 ) Tag DNA 聚合酶（不同厂家）。
4. 注
1. 尽管 NexT DNA 混编方法的整体错误率已经很低，尿苷酸交换 PCR 中仍然推荐使用高保真聚合酶。但是，须谨慎选择该聚合酶的种类以使其能够有效地掺入尿苷而不是在模板的尿苷酸位点停滞。Vent exo+ (NEB) 以及非尿苷酸停滞突变体的 pfu 聚合酶（Stratagene) 都被报道可以掺入尿苷。
2. 很小的碎片能够被放射性同位素标记显示。这种情况下，加入 0.5 μl 的 3.3 μmol/L 32P-dCTP 溶液（约 0.5 μCi) 到尿苷交换 PCR 混合物。对于放射性实验，使用 PCR 清洁试剂盒之前不用经过琼脂凝胶电泳步骤（见 10.3.2.4 )，因为非放射性模板不影响放射性片段的显示。
3. 由于热循环仪最适工作体积的限定，我们用了 4 个 50 μl 试管的尿苷交换 PCR 反应。
4. 需要分离含有尿嘧啶的产物及不含尿嘧啶的模板，以确保没有模板被保留到下—步。
5. 我们更倾向于利用两个柱层析进行平行实验以节省时间。这样，我们在两个试管中分别进行尿苷交换 PCR ( 见 10.3.3 ) 的酶及化学切割实验以保证我们的热循环仪在合适的工作体积内。样品可以在 10.3. 5.1 第二步或者 10.3.4 第四步组合起来进行片段纯化。
6. 酶解 2 h 或者更长时间产生同样结果，表示酶解过程的选择性及一致性。
7. 哌啶有毒，需要在通风厨中操作。所有其他含有哌啶的溶液，如 Qiaex II 试剂盒中（见 10.3. 5.1 ) 用过的俘获缓冲液，需要谨慎处理，弃于密闭试管中。
8. 我们制备的凝胶最多用 3 d。加入的尿素粉末影响体积，需要被考虑到终浓度中。体积为 9 块凝胶的溶液被用于制备 8 块凝胶。
9. 哌啶影响片段的电泳性质，因此，应该尽最大可能使其挥发。
10. 对于放射性实验，仅仅使用 7μl DNA-甲酰胺样品，补充加入 3 μl 60% 的蔗糖溶液和 7 μl H2O；混匀后取 15 μl 样品加入凝胶中。
11. 对于放射性实验，寡核苷酸和 DNA 分子质量梯度被 32P-γATP 磷酸化，然后用分子筛纯化去除多余的 32P-γATP。我们利用 SephadexG-50 柱料，但是任何其他核酸去除试剂盒都适用。
12. 为避免染料与 DNA 片段叠合，我们只是在分子标记中用了溴酚蓝而没有在样品中用。
13. 染色孵育时间不要超过 5 min，否则较小的片段会开始从凝胶中跑出。因此，用 SYBR green II 染色比较困难，因为这种染剂染色需要孵育 5~10 min。请注意尿素凝胶在紫外光下很快变白。
14. 我们发现，对于避免损失小片段，QiaexII 试剂盒是最适用的。尽管厂家推荐使用的 DNA 片段范围是大于 40 个碱基，我们发现此试剂盒可以很好地回收大约 20 个碱基的片段。
15. 由于试剂盒基质会结合 DNA 从而影响重组装反应，因此离心两次来确保 DNA 片段不会被微量的基质材料污染是很必要的。
16. —般来说，如果我们开始就用 7 μg 或更多的尿苷交换 PCR 反应产物进行实验，就不必检测 DNA 片段的浓度。
17. 供应商推荐使用 1: 10000 的稀释倍数，我们发现对于小的和低浓度的 DNA 片段 1:5000 的稀释效果更好。
18. 最好使用白色的 96 孔 SBS 板，因为白色板会增强荧光。
19. 我们选用了较高量的 dNTP，因为在长达 4 h 的重组装反应中 dNTP 可能降解。
20. 选择此体积以确保多样性。
21. 基因中尿苷掺入的所有可能类型的总和是 1，但是所有片段的概率总和要大一些，因为每种类型可以产生好几种片段。
22. 这个计算包括长度为零碱基的片段，当两个尿嘧啶紧挨在一起时会产生这种情况。
23. 同位素放射自显影的胶可应用 X 射线光片显影。但是，现代化影像设备可以给出更大的线性测量范围。
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