用交换反应进行5'突出端DNA分子的磷酸化

T4 噬菌体多核苷酸激酶催化的交换反应（Van de Sande et al. 1973; Berkner and Folk 1977) 是一个标记 5' 端 DNA 的快速方法。与正向反应不同的是，它无需 DNA 去磷酸化。正向反应在略偏酸性（pH 6.4）的咪唑缓冲液中进行，以刺激酶促去磷酸化 (Berkner and Folk 1977)。交换反应的最佳 K_m 值（ADP 为 300 μmol/L，ATP 为 10 μmol/L），均比在试验管中容易达到的值高，因此标记效率很少超过 30%。然而，交换反应效率通过在反应混合物中加入亚精胺和聚乙二醇大为改善（Lillehauget al. 1976; Harrison and Zimmol/Lmerman 1986a)。

T4 噬菌体多核苷酸激酶 DNA
ADP 乙酸铵 ATP EDTA 乙醇 咪唑缓冲液 聚乙二醇
液体闪烁计数仪 Sephadex G-50 离心柱 Sephadex G-50 柱

一、材料

1. 缓冲液和溶液

ADP (1 mmol/L)

乙酸铵（10 mol/L）

ATP (10 mmol/L)

EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)

乙醇

10X 咪唑缓冲液（500 mmol/L 咪唑盐酸（pH 6.4），180 mmol/L MgCl2，50 mmol/L DTT，1 mmol/L 亚精胺盐酸，1 mmol/L EDTA (pH 8.0)）

聚乙二醇（24% m/V PEG 8000，水配制）

2. 酶和缓冲液

T4 噬菌体多核苷酸激酶

3. 核酸和寡核苷酸

DNA (10~50 pmol m 5'-磷酸化的末端）

4. 放射性化合物

[γ-³²P] ATP ( 10 mCi/ml，比活性为 3000~7000 Ci/mmol）

5. 专用设备

液体闪烁计数仪，能通过切仑科夫辐射定量 ³²P

Sephadex G-50 离心柱，用 TE（pH 7.6) 平衡

或

Sephadex G-50 柱（1 ml)，用 TE ( pH 7.6) 平衡

二、方法

1. 在一个微量离心管中按下列顺序混合：

含 5' 末端磷酸的 DNA                      10~50 pmol

10X 咪唑缓冲液                                5 μl

1 mmol/L ADP                                 5 μl
 
50 nmol/L ATP                                 1 μl

10 mCi/ml [γ-³²P] ATP

（比活性为 3000~7000 Ci/mmol)       20~100 pmol

水                                                   加至 40 μl

24% (m/V) PEG                              10 μl

T4 噬菌体多核苷酸激酶（20 单位）  1 μl

轻弹管外壁以混合各成分，37℃ 温育反应 30 min。

2. 加入 2 μl 0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0) 以终止反应。用液体闪烁计数仪的切仑科夫计数检测反应混合物中的总放射性活度。

3. 通过下列任一方法分离放射性标记探针与未掺入dNTP：

用 Sephadex G-50 离心柱层析

或

用 1 ml Sephadex G-50 柱（用 TE 平衡）常规尺寸排阻层析

或

进行两轮乙酸铵和乙醇选择性沉淀放射性标记的 DNA

4. 通过契仑科夫计数测定探针制品中的放射性量，用探针中放射性含量除以反应混合物中的放射性总量来计算放射性标记物转移到 5' 端的效率。