以phenol/chloroform 进行DNA 萃取

仪器用具： 微量离心机

药品试剂：

Plasmid DNA 酵解产物： #1 （pBlueGus/HindIII）， #2 （pBlueGus/BamHI）；Phenol/chloroform/isoamyl alcohol （25:24:1） 以下简称为PCI;Chloroform/isoamyl alcohol （24:1） 以下简称为CI;3 M NaOAc （醋酸钠pH 5.2）；纯酒精及70%酒精

方法步骤：

◆ 注意！进行这一部份实验的前，请先确定pBlueGus/HindIII 与pBlueGus/BamHI 两者的酵解反应都已经完全。

1） 于酵解反应 #1 与 #2 的微量离心管分别加入182 μL 去离子水。

2） 以200 μL PCI 萃取一次，亦即加入PCI 后，以Vortex 震荡混合，并在室温离心3 min。

3） 以微量移液器P200 将上层液移至新的微量离心管。

4） 加入等体积的CI,以Vortex 充分震荡混合，并在室温离心3 min。

5） 以微量移液器P200 将上层液移至新的微量离心管。

6） 加入0.1 倍体积的3 M NaOAc （pH 5.2） 及2.5 倍体积绝对酒精。

7） 置于 -20℃过夜，或于 -80℃放置30 min，以便沉淀DNA.

隔天：

1） 自冷冻柜取出微量离心管，以14,000 rpm 离心10 min。

注意： 请利用这一段时间参照『基本操作技术』所描述的步骤准备一片1.2%洋菜胶体。 Ethidium bromide 是一种强力致癌物质，严禁戴着手套到处乱摸！

2） 小心地倒出上清液。

3） 徐徐加入0.5 mL的70%酒精 （预先放在 -20℃预冷）。小心不要动到DNA沈淀。

4） 以14,000 rpm 低温离心5 min 的后，倒去上清液，并将微量离心管倒置于一张干净的卫生纸上30 min,以便风干DNA.也可以用SpeedVac 干燥DNA,但应小心处理，以免DNA 沉淀不见了。

5） 以10 μL dH 2 O/DEPC溶解DNA。

6） 依照下表，自pBlueGus/BamHI 与pBlueGus/HindIII 各取1 μL DNA 以洋菜胶体电泳进行分析，并估算其浓度。

DNA 浓度的估算请以 DNA/HindIII 量为参考值