用于基因芯片分析的血液样品的准备

由于血液中的红细胞没有细胞核，用于基因表达分析时，往往是分析血液中白细胞的基因表达情况。因此首先需要把血液中的白细胞进行分离。

下面方法是我们实验室摸索的适合基因芯片技术白细胞分离的过程。

一、实验材料：

淋巴细胞分离液（天津TBD生物技术发展中心）；

灭菌生理盐水（普通0.9%生理盐水灭菌即可）；

Trizol试剂（Invitrogen公司）

各种取样器具高温灭菌即可；

仪器设备：带水平转头的离心机，

具体过程：以2 ml全血为例

1、将2 mL抗凝血（肝素或者EDTA盐抗凝都可），以3,500 转/分，离心10分钟。将会看到血液分为2层，上层是淡黄色的血浆，约占60%。

2、用巴士滴管或吸管将上层血浆吸出，还剩约1ml血细胞层，在血细胞层中加入1：1体积，即约1ml的灭菌生理盐水，混匀，见图2。

图2 在血细胞中加入生理盐水充分混匀

3、以下是把12ml生理盐水与血细胞混合物（相当于12ml全血）合并成一管后分离白细胞过程。将24 mL淋巴细胞分离液（是全血体积的2倍）预先加入灭菌的50 mL 离心管中。将与生理盐水混合的血细胞缓慢加入淋巴细胞分离液液面上，注意尽量不要让血细胞层掺入到淋巴细胞分离液层去，此过程可见图3；然后以1500转/分，离心20 分钟（离心机要求水平转头）。可以看到液体分为三层，上层是淡黄色的血浆，中间一层乳白色，最下面一层是红色的血细胞。在中间层和上层交界处是有一层白色的膜，即白细胞层，同时在明显的白细胞层下面有较厚的乳白层液体，此层液体中也含有白细胞，但量较少，若血液足够，可以考虑不要此层（若白细胞层不很明显而乳白色液体层太厚，可以2500转/分，继续离心10 分钟以加强白细胞的分离效果），见图4。

  图3 将与生理盐水混合的血细胞缓慢加入　　　　图4 血细胞在淋巴分离液中的分离效果
淋巴细胞分离液液面上                                                                                    　　     

4、用巴士滴管或移液器收集界面上的白细胞层，放入灭菌的1.5 mL EP离心管中，以 10,000 转/分，离心5 分钟，吸掉上清。可见白色的沉淀，有时白色的沉淀上还混有红色的血细胞（少量红细胞无妨），见图5。

图5 分离的白细胞再次离心后形成的沉淀

5、吸去上清液，在细胞沉淀中，加入1ml Trizol试剂，用移液器充分抽打，混匀，直到形成清亮不粘稠度的液体（表明细胞被充分溶解，基因组DNA被充分打断）

6、后续可以按照Trizol试剂的标准操作抽提总RNA。也可以把此Trizol试剂保存在生物冰（低于15℃即可）邮寄给我们，由我们来完成后续的抽提过程。一般每5 ml全血可以得到10-15ug总RNA，得到的总RNA质量如图6所示：

图6 白细胞中抽提RNA的电泳图

注意事项：

A. 在一些方法中，是在全血中直接加淋巴细胞分离液后离心分离红细胞；这样得到的白细胞沉淀中带有较多的血浆蛋白，影响RNA的抽提，因此我们建议用以上方法，先把血浆弃去后再加淋巴分离液。

B. 在一些方法中，分离得到的白细胞先用RNAlater保存进行运输；由于分离的白细胞往往污染有红细胞，红细胞会影响 RNAlater的保存效果；另外，保存在RNAlater中的白细胞在重新回收提取RNA时还有部分损失。

因此若实验室有Trizol试剂，我们建议直接用Trizol试剂把白细胞溶解，在Trizol试剂中的RNA是相对稳定的，-20℃可以保存一个星期，-70℃可以保存一个月。

C. 淋巴细胞分离液一般要求保存在4℃中。淋巴细胞分离液从冰箱取出后，不要马上应用，以避免对细胞冷的刺激，引起基因表达的改变。需待溶液温度升至室温时，混匀后使用。

D. 整个分离过程中，温度应在18-28℃；温度过高与过低均影响分离质量。