蛋白质比色定量法

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【基本原理】
游离状态的考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈红褐色，与蛋白质结合后呈蓝色，蛋白质含量与颜色的深浅成正比，经595nm测定，可作出蛋白质含量与吸光度值的标准曲线，并求出未知样品的蛋白质浓度。
【器材】
1．可见光分光光度计
2．试管
【试剂】
1．0.9% NaCl
2．蛋白质标准溶液（500μg/ml）：小牛血清白蛋白50mg加生理盐水至100ml
3．考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G250 100mg加95%乙醇50ml,加85%(W/V) H3PO4 100ml加蒸馏水至1000ml，置棕色瓶过夜，用双层滤纸过滤。

【操作步骤】
（一）标准蛋白质曲线的绘制
1．取小试管7支，按下表操作

2．混匀后静置5min ，以１号为空白，595nm比色。
3．结果处理：以各管光密度为纵坐标。各管所含蛋白质量为横坐标,制成标准曲线。
（二）蛋白质含量测定
1.按下表操作

 

 

 

测定管 空白管

待测液(ml)

生理盐水(ml)

考马斯亮蓝(ml)

0.10 —

0.90 1.00

5.00 5.00

2．混匀静置5min 后，以空白管调零，595nm室温比色，根据标准曲线确定样品中蛋白质含量。