非同位素原位杂交组化与免疫组化联合法

步骤如下：

　　（1）将切片漂浮于能经受高压灭菌的器皿中。0.1mol/l PBS pH7.2冲洗3×5min。
　　（2）0.1mol/L甘氨酸PBS冲洗5min。
　　（3）0.4% Triton X-100 PBS 15min。
　　（4）1μg./ml 蛋白酶 K（0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA 配），37℃保温30min。
　　（5）4%多聚甲醛PBs 5min。
　　（6）PBS冲洗2×min。
　　（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配）10min。
　　（8）2×SSC冲洗10min。
　　（9）将切片用灭菌吸水纸吸干，然后入杂交液。核酸探针浓度为0.25～0.5μg./ml。每一正常成年大鼠脑冠状切片15μl杂交液足够。43℃保温12～16h。
　　（10）4×SSc 37℃冲洗30min。
　　（11）2×SSC（含RNasea 20μg/ml）37℃保温30min。
　　（12）1×SSC和0.5×SSc 37℃分别冲洗30min。
　　（13）0.05mol/l PBS冲洗3×5min。
　　（14）0.5%H2O2 PBS室温20min。
　　（15）0.05mol/l PBS 冲洗2×5min。
　　（16）碱性 磷酸酶 标记抗地高辛抗体（Fab）与抗蛋白或多肽等抗体混合液，前者一般1：1000稀释，后者则因抗体而异。稀释液：1%BSA，0.4%Triton X-100 ,0.05mol/L PBS pH7.2，4℃孵育24h。
　　（17）0.05mol/l PBS冲洗4×5min。
　　（18）二抗（1：100～1：200）37℃保温1h。
　　（19）0.05mol/l PBS冲洗3×5min。
　　（20）PAP（1：200～1：400）37℃保温1h。
　　（21）0.05mol/l PBS冲洗3×5min。
　　（22）DAB显色液（0.05%DAB + 0.03% H2O2,0.05mol/L PBS pH7.2配）显色5～10min。
　　（23）0.05mol/l PBS冲洗3×5min。
　　（24）TSM，冲洗2×5min（TSM1：0.1mol/l Tris – HCl pH8.0,0.1mol/L NaCl,0.01mol/L MgCl2）.
　　（25）硝基四氮唑蓝（400μg/ml）和5-溴-4-3-吲哚磷酸（200μg/ml）混合液（TSM2配显色混合液）显色1～3h，避光。
　　（26）20mmol/l EDTA 终止显色。
　　（27）将切片贴于涂有铬矾明胶的载片上，空气干燥。
　　（28）梯度酒精脱水，透明、封片。