GST－融合蛋白的表达与纯化

原理

GST 纯化系统是利用GST （glutathione-S-transferase ）融合蛋白与固定的谷胱甘肽（GSH）通过硫键共价亲和，通过GSH交换洗脱的原理来进行纯化 。1ml树脂大约可结合5-8 mg融合蛋白，并可反复使用数次。试剂u IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷） 2g IPTG 溶解入10ml 水，过滤除菌，分装，-20℃保存。u Lysis buffer （50ml）1)2.5ml 1 M Tris，pH8.0 2)0.1ml 0.5ml EDTA 3)0.292g NaCl4)0.5ml Triton X-100 5)0.25ml 1M DTT u Elution buffer 1)0.615g glutathione 2)10 ml 1M Tris，pH8.0 3)90ml distilled water .

操作步骤

1)挑一个克隆至2ml LB液中（Amp+ ）

2)37℃振摇至OD600值约为0.6

3)将2ml菌液加入100 ml LB中

4)37℃振摇至OD600值约为0.6

5)加入IPTG至终浓度为1mM

6)继续摇3～4h

7)离心（5000 rpm，5min，4℃）

8)用10×柱体积的lysis buffer悬浮细菌

9)超声破碎细胞

10)离心（12,000rpm,15min,4℃），取上清

11)用滤纸过滤

12)加0.5 ml 50%谷胱甘肽琼脂糖beads于层析柱

13)5×柱体积的lysis buffer洗层析柱

14)样品过柱

15)5×柱体积的lysis buffer洗层析柱

16)3×柱体积的elution buffer洗脱蛋白

17)收集蛋白：0.5ml/管 18)取20ml样品SDS-PAGE鉴定可以在buffer里增加点蛋白酶抑制剂，防止蛋白的降解。