光镜免疫金组织化学染色方法的原理与步骤

相关专题

免疫胶体金技术专题

一、原理

本法是由Geoghegan等(1978)首次应用金标探针检测B淋巴细胞表面抗原 ，将胶体金颗粒(大于20nm)标记在第二抗体或SPA分子上，制备成金标二抗。其原理是当特异性抗体与抗原结合后，用金标二抗或金标SPA与特异性抗体结合，形成抗原-抗体-金标抗体复合物，此时在光镜(10X100倍)下可见红色颗粒物，即为抗原-抗体结合物。该方法称为免疫金染色(immunogold staining,IGS)。其特点简便、快速(因不需银显影)，要求金标抗体浓度高，而且金颗粒直径大于20nm.

二、IGS间接法染色步骤

(1)4/lm石蜡切片常规脱蜡至水，0.05mol/L(pH7.4)TBS洗2×3min.

(2)1%卵蛋白[EA,用0.05mol/L(pH7.4)TBS稀释]温育15min,不洗。

(3)加入适当稀释特异性抗体，37℃温育1h，0.05mol/L(pH7.4)TBS洗2X3min。

(4)0.02mol/L(pH7.4)TBS(内含0.1%BSA )洗10min。

(5)1%卵蛋白温育15min，不洗。

(6)适当稀释的金标记SPA30nm(PAG30nm)室温孵育1~2h,0.05mol/l(pH7.4)TBS洗3X3min。

(7)双重蒸馏水洗5min，1%戊二醛洗10min，双重蒸馏水洗5min.

(8)用0.01%伊文斯蓝衬染3min，50%缓冲甘油封片。

(9)结果观察：阳性呈现红色细颗粒状。