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TEM 操作图解:一文读懂外泌体鉴定,学霸入门必备

宇玫博生物

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TEM 透射电镜是外泌体鉴定的金标准,对于所有做外泌体的朋友们来说,是必经之路,基于很多老师们的呼声,我们的研究人员,经过细致化整理,把所有的操作过程都整理出来,供各位参考,经验有限,有不当之处,还请多多沟通。
 
一、首先,我们看看电镜的原理是啥?
然后,电镜的结构也是比较复杂的!



二、那么,我们看看样品有哪些要求?
样品要求:
1、能被电子束穿透(薄)
2、耐电子束轰击
3、有磁性的样品不可以放置
4、长纤维样品若需上样需加盖铜网
 

三、接下来,我们看看规范化拍摄 Umibio 是怎么操作的?
声明:本次操作基于我司最近正在使用的 HT7700;
1、送样要求:样品尽可能浓,颗粒浓度 1.0E+10;
2、拍摄规范:样品以茶托状(有明显凹陷的)球形,椭球形或扁圆形,尺寸在 30-150nm,有双层膜结构的颗粒为目标进行拍摄;照片以轮廓清晰,分辨率高,焦距合适(既没有过焦的虚影,也没有欠焦的黑边),背景杂质少,明暗适宜,颗粒居中,整体美观为佳;

默认拍摄 100nm 一张,200nm 三张,500nm 一张;
注:铜网中样品焦距无法调清时以调试后的最佳结果拍摄,样品中无特征明显的颗粒或无颗粒时,拍摄 500nm 的样品颗粒物或制样“地形”三张;
 

命名:样品名-标尺-张数。

 
四、那么问题来了,我们是怎么制样的呢?
1、制样用品:培养皿,滤纸,碳膜铜网,无尘纸;计时器, 镊子,10μL 移液枪及枪头等;
 

2、制样步骤:
1)滤纸铺在培养皿内,用镊子将通网正面朝上小心放置在滤纸上;
2)移液枪取 10μL 样液滴在铜网上,呈水滴状站立,计时 2min,使样本颗粒渗透,2min 后用针头将液滴挑开;
3)取 10μL 染液以同样方式滴在铜网上,染色 1.5min,染色结束后用针头将液滴挑开,用无尘纸将多余染液吸掉。
 

五、重点来了,电镜的详细操作步骤有哪些?

1、确认所有 COL 电源的按钮为 ON,启动 PC;
 

2、 左上角“operation”下,打开“加速电压/灯丝设定”窗口和“CCD 相机操作”窗口;
 

3、点击“HV on”加速电压上升,点击“Filam on”灯丝电压上升;
 

4、上样前操作-拔出样品杆
 

1)将样品杆顺进样轨道平行线向外拔,至有阻力拔不动时顺时针右转小角度(约 15°),再次向外拔;
2)至有阻力拔不动时逆时针左转(约 45°)至样品杆上定位销完全移至定位销孔,样品仓红灯亮起;
3)将样品仓放气按钮向下拨至“Air”一侧,放气后灯灭,向外拔出样品杆。

5、上样中操作
 

5.1 将样品杆小心放在支架上,塑料把手在左,样品端在右;(样品杆银色不锈钢部分可以手碰,黄铜部分不可以用手触摸)
5.2 样品装入样品杆:
(1)    用小圆杆抵住样品杆前端小孔,按住往左推拉,另一只手用镊子夹住压片左端小角取出压片;
(2)    用镊子夹住样品对准样品杆前端小圆洞放入;
(3)    压片凹面朝上,圆洞对准样品杆上圆洞,两角抵住右端凹槽放在样品杆上;
(4)    用小圆杆抵住样品杆前端小孔,按住往左推拉,压片自然落下,松手后压片被抵住;
(5)    用洗耳球吹走灰尘;

6、上样后操作-插入样品杆
 

6.1 将样品杆按照定位销与销孔对应的方向插入至有阻力,将样品仓排气按钮向上拨至EVAC一侧,红灯亮;
6.2 等抽真空完成后,绿灯亮起,并伴随“滴---”的声音,紧接将样品杆小心顺时针右旋至有阻力时,微微逆时针左旋,再将样品杆完全送进样品仓,上样完成。

7、点击 “Beam on”:待左上角束流加至 10μA 左右时,可以开始调试参数寻找目标样品;

8、“LENS RESET”——初始化参数;
9、“BRIGHTNESS”键——调节亮度;移动轨迹球——调节视野;“MAGNIFICATION”键——调节放大倍数;
10、调节光圈;
11、调节样品高度;
 

12、目标样品寻找记录:
12.1 通过调节放大倍数,视野亮度和轨迹球找到目标样品并将其移动到视野中央;
12.2 调节“BRIGHTNESS”至亮度到-12,点击“RUN”,    进入放大模式;
12.3 左右旋转“FOCUS”调焦;
 

12.4 设置照片附带信息;
12.5 设置照片保存路径;
12.6 固定照片并保存;
12.7 点击“stop”退出拍照模式;
 

13、点击“Beam off”,结束拍照;
14、勾选并点击“RESET”,使镜头归位;
 

15、可以重新更换样品继续拍照,或取出样品结束拍照,结束后样品杆需放回样品仓内;
16、数据上传:在电镜旁边的电脑上按保存位置找到自己拍摄的照片,双击快捷方式打开数据上传客户端,将文件夹拖到页面中,输入自己的账户,等待数据上传结束。
 

17、关机
17.1 依次点击“Filam off”,“HV on”,关掉拍照和电压灯丝窗口;
17.2 数据传输电脑关闭后,将 COL 按钮按到“O”一侧,关闭仪器。
 

六、最后,我们看看有哪些常见问题吧!
1、视野飘逸,无法聚焦和固定照片
1)上样没有夹紧铜网;
2)电子束轰击,破坏碳膜;
3)上样/制样过程中铜网正反颠倒;

2、染色过深或过浅:染液:5% 磷钨酸溶液,PH 中,染色 1.5min;

3、照片不够清晰,对比度较弱
1)制样太厚;
2)相机原因;
3)手动调节 Gamma 可适当增加对比度-耗时;

4、视野中的杂质是什么:大白圆球,大梭形,小黑圆球,不明颗粒。
 
文章来源:宇玫博生物
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