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短时间获得更长活细胞成像的 4 个技巧

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实现活细胞成像自动化以及简化任务对于达到实验目标至关重要。这里介绍 4 个需要留意的技巧:

 

1. 让标本在温暖、稳定的环境中保持健康状态

活细胞成像过程中最大挑战之一就是如何在温暖舒适的培养箱之外确保样品健康并能够在显微镜下表现正常。

可以利用能够为细胞提供稳定温度、湿度和  CO密度的显微镜专用载物台上式培养箱或封闭式培养箱确保您的标本环境尽可能适宜。

另外可以加热物镜,否则其作为寒冷的接触源可能会损害样品的健康。

注意,微孔板外围区域可能存在比中心区域更高的环境波动风险,因此务必使用中心区域的孔,并避免使用边缘附近的孔影响稳定性。比如说,使用的是 96 孔板(12×8 孔),就只使用中心的 60 孔(10×6 孔)进行实验。

图 1.载物台上式培养箱

 

2.通过创造稳定的环境温度改善聚焦效果

需要考虑的因素是室内温度,细微的温度变化也会影响到成像性能。

显微镜的环境温度稳定性对于活细胞的高倍率观察尤其重要。由于高数值孔径观察的景深较浅,因此即使温度变化造成很小的Z漂移,系统也可能会因此离焦。

为了优化环境条件,开始实验之前请确保打开空调并保持室温稳定。另外为了提高稳定性,还要避免气流从空调直接吹向显微镜。

 

3.通过精确设置焦点和校正环提高图像质量

解决诸如 Z 漂移之类时间性波动的另一种方法是开始活细胞实验前尽可能精确设置焦点和环校正。

研究人员往往只会细心调整焦点,而忽略了校正环。然而,校正环能够显著改善图像的质量,在进行深层组织观察或使用高数值孔径物镜时尤其如此。

校正环的理想位置取决于诸如样品折射率、观察平面深度和盖玻片厚度等许多因素。即便大多数盖玻片和玻璃底培养皿的厚度只有 170 μm(#1.5),其仍然会导致波动,并且更重要的是,不能以塑料培养皿推测这些值。

因此,务必通过检查图像对比度的方式对校正环进行精确调整,尤其是在使用塑料微孔板或培养皿时更要如此。

通常情况下,环校正必须要在现场进行调整。对于诸如使用多光子显微镜进行深层观察等需要主动调整环校正的实验,这可能意味着需要在实验室中花费更多的时间,但是可以选择使用电动校正环自动执行这些调整。

 

图 2.物镜上的校正环带有可指示盖玻片厚度的指示器

 

4.使用专用聚焦模块让样品保持聚焦

可是如果发生 Z 漂移怎么办?即使完成上述所有操作,图像也可能无法始终保持对焦。毕竟,很多因素都会造成Z漂移。其既可能因诸如添加试剂等主动和有益改变所致,也可能由于有人在室内行走或环境温度变化造成的物理振动引起。

尽管大多数电动显微镜均具备基于图像对比度的自动对焦功能,但仍然有其局限性:

  • 调整范围有限
  • 基于对比度聚焦的激发光会造成光毒性

确保在活细胞实验过程保持对焦的一种方法是使用专用聚焦模块,比如 TruFocus 基于近红外(NIR)激光的 Z 漂移补偿器。近红外光还可在长时间观察过程中尽可能地降低光毒性以及成像波长的串扰。

该模块的单次自动对焦(AF)模式可预防不必要的照明,而连续自动对焦模式可用于实时观察或快速现象的连续图像采集。

图 3.奥林巴斯 TruFocus Z 漂移补偿器让样品清晰聚焦

 

 

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