优化流式配色的小技巧

流式配色可以算的上是一门艺术：我们需要平衡抗原表达水平和荧光染料亮度，从而得到令人满意的实验结果。

在荧光素的选择上，除了传统的PE、APC等荧光蛋白和FITC等合成类小分子外，串联染料的出现大大扩展了可用荧光素的选择范围。

 

什么是串联染料？

串联染料由两个共价连接的荧光分子组成。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即荧光共振能量转移（FRET）现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。

激发和发射波长之间的差异称为“斯托克斯频移”，而在选择用于流式细胞实验的荧光素时，我们希望具有尽可能大的斯托克斯频移，以将发射光与激发光源可靠地区分开。因此，串联染料在这个意义上比单分子染料更有优势。

 

但是有些串联荧光染料也是有相当的局限性的，尤其是在多色流式实验时会更大概率出现荧光溢漏的问题。

例如，当使用PerCP-Cy™5.5染料时，我们可能认为只会在488 nm激发范围相关的通道中检测到信号，然而这实际上是错误的，因为该蛋白质会被635 nm激光激发（图1）。当同时用PerCP-Cy5.5和APC对细胞进行染色时，PerCP-Cy5.5在635 nm激发范围产生的信号就会对APC的信号产生干扰，尤其是当APC染色的抗原表达水平较低的时候，从而影响实验结果。而用美天旎的PE-Vio^®615染料去替换PerCP-Cy5.5可以很好地解决这个问题，因为PE-Vio^®615不会被635 nm激光激发（图1）。

 

图1：PerCP-Cy™5.5会被635 nm激光激发，而PE-Vio^®615不会被635 nm激光激发

 

图2对比了PE-Vio 615与PerCP-Cy5.5染料的光谱扩展，以及两种荧光素对APC通道背景信号的影响。用美天旎的MACSQuant^®Analyzer 10，488 nm激光激发下，滤光片设置为655-730 nm的B3通道中检测两种荧光素的信号。我们可以看到，PE-Vio 615很大程度上减少了对APC通道灵敏度的影响，为PerCP-Cy5.5提供了更灵活的替代方案。

 

图2：PE-Vio 615与PerCP-Cy5.5的比较。数据由休斯敦大学Richard Simpson博士提供。