优化流式配色的小技巧

流式配色可以算的上是一门艺术：我们需要平衡抗原表达水平和荧光染料亮度，从而得到令人满意的实验结果。

在荧光素的选择上，除了传统的 PE、APC 等荧光蛋白和 FITC 等合成类小分子外，串联染料的出现大大扩展了可用荧光素的选择范围。

什么是串联染料？

串联染料由两个共价连接的荧光分子组成。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在 10 nm 以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即荧光共振能量转移（FRET）现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。

激发和发射波长之间的差异称为「斯托克斯频移」，而在选择用于流式细胞实验的荧光素时，我们希望具有尽可能大的斯托克斯频移，以将发射光与激发光源可靠地区分开。因此，串联染料在这个意义上比单分子染料更有优势。

但是有些串联荧光染料也是有相当的局限性的，尤其是在多色流式实验时会更大概率出现荧光溢漏的问题。

例如，当使用 PerCP-Cy™5.5 染料时，我们可能认为只会在 488 nm 激发范围相关的通道中检测到信号，然而这实际上是错误的，因为该蛋白质会被 635 nm激光激发（图 1）。当同时用 PerCP-Cy5.5 和 APC 对细胞进行染色时，PerCP-Cy5.5 在 635 nm 激发范围产生的信号就会对 APC 的信号产生干扰，尤其是当 APC 染色的抗原表达水平较低的时候，从而影响实验结果。而用美天旎的 PE-Vio^®615 染料去替换PerCP-Cy5.5 可以很好地解决这个问题，因 PE-Vio^®615 不会被 635 nm 激光激发（图 1）。

图 1：PerCP-Cy™5.5 会被 635 nm 激光激发，

而PE-Vio^®615 不会被 635 nm 激光激发

图 2 对比了 PE-Vio 615 与 PerCP-Cy5.5 染料的光谱扩展，以及两种荧光素对 APC 通道背景信号的影响。用美天旎的 MACSQuant^®Analyzer 10，488 nm 激光激发下，滤光片设置为 655-730 nm 的 B3 通道中检测两种荧光素的信号。我们可以看到，PE-Vio 615 很大程度上减少了对 APC 通道灵敏度的影响，为 PerCP-Cy5.5 提供了更灵活的替代方案。

图 2：PE-Vio 615 与 PerCP-Cy5.5 的比较。数据由休斯顿大学 Richard Simpson 博士提供。