原位杂交技术的基本步骤与原理
原位杂交有很多种方法,但其基本实验程序相近的
包括:组织和器材的特殊处理
取材、固定、切片
杂交前处理
探针的制备和预杂交
杂交反应
杂交后处理
检测杂交信号,进行结果分析
(一)器材的特殊处理
DNA:稳定性较好,一般不需特殊处理。常规的石蜡或冷冻切片均适用于组织或细胞内的DNA原位杂交
RNA:RNA酶几乎无处不在,而且一般的消毒方法不能将其灭活。因此,当检测RNA或用RNA作为探针时,从标本准备到杂交结束前,都要注意预防
去除或抑制RNA酶方法:
1. 物理方法:
对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器具作高温烘烤(180-200℃干烤4-6小时)
对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒
2. 化学方法:
焦碳酸二乙酯( DEPC )
RNA酶抑制剂,有毒
增强标本通透性与核酸探针穿透性
常用方法:蛋白酶消化、去污剂处理、酸酐处理和稀酸洗涤等
(1)蛋白酶K(甘氨酸)、胃蛋白酶
酶的浓度和孵育时间应视标本种类、固定剂种类、切片厚度等而确定
探针——预变性的探针
高浓度盐类(柠檬酸钠)——增加杂交体的稳定性
甲酰胺——可降低解链温度
硫酸葡聚糖——对DNA有浓缩作用,可提高杂交的反应速度10倍以上,但不影响探针的洗脱强度
牛血清白蛋白和鲑鱼精DNA或RNA——用于阻止探针与非特异位点或非目标DNA杂交。