FISH实验的小技巧

原位杂交技术的基本步骤与原理 原位杂交有很多种方法，但其基本实验程序相近的 包括：组织和器材的特殊处理 取材、固定、切片 杂交前处理 探针的制备和预杂交 杂交反应 杂交后处理 检测杂交信号，进行结果分析 （一）器材的特殊处理 DNA：稳定性较好，一般不需特殊处理。常规的石蜡或冷冻切片均适用于组织或细胞内的DNA原位杂交 RNA：RNA酶几乎无处不在，而且一般的消毒方法不能将其灭活。因此，当检测RNA或用RNA作为探针时，从标本准备到杂交结束前，都要注意预防 去除或抑制RNA酶方法： 1. 物理方法： 对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器具作高温烘烤（180-200℃干烤4-6小时） 对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒 2. 化学方法： 焦碳酸二乙酯( DEPC ) RNA酶抑制剂，有毒 增强标本通透性与核酸探针穿透性 常用方法：蛋白酶消化、去污剂处理、酸酐处理和稀酸洗涤等 (1)蛋白酶K（甘氨酸）、胃蛋白酶 酶的浓度和孵育时间应视标本种类、固定剂种类、切片厚度等而确定 探针——预变性的探针 高浓度盐类(柠檬酸钠)——增加杂交体的稳定性 甲酰胺——可降低解链温度 硫酸葡聚糖——对DNA有浓缩作用，可提高杂交的反应速度10倍以上，但不影响探针的洗脱强度 牛血清白蛋白和鲑鱼精DNA或RNA——用于阻止探针与非特异位点或非目标DNA杂交。