你不一定知道的实验小技巧汇总

大肠杆菌转化

制备好了一批感受态，最好马上转化一种已知质粒。与此同时，取一点感受态接种到含抗性的固/液体培养基培养来做对照。这样第二天即可以知道这批感受态是否还有外源质粒，又可以知道这批感受态转化效率的高低。如果合格，那以后就可以放心使用。

做克隆挑斑时，可以用牙签沾取试管里的培养菌液，在一块相应抗性的平板上点一下。标注清楚，培养时间稍长一点，待长成较大菌落后收取。以后需要哪一个菌，就在平板上挑取。这样既方便快捷，又可以保证菌的一致。

质粒提取

抽提质粒时，加入 Sloution II 和 III 后要求轻柔混匀。个人觉得不用这样，只要不是非常剧烈，可以快速混匀。尤其可以运用在一次抽提多管质粒的时候，这样可以快速，而且效果一点也不差。

抽提质粒时，用无水乙醇沉淀的时间可以由实验操作者来决定，如果时间充裕可以 30 min，否则 8-10 min 也可以。至于温度，个人觉得 -20 度好于常温。如果加入可醋酸钠，会较容易形成盐类杂质，所以时间短一些更好。

Western blot

我们摸索抗体的工作浓度及反应条件都是采用点杂交。用膜的边角料，直接将蛋白点在膜上即可。每次 2ul ，然后烘干，反复点样大约 8ul 左右即可。注意点样时，用枪头尖把蛋白向四周拔下，然后直接抗体孵育显色即可。抗体稀释液一般 100 ul 即可，这样即节省抗体，又节省膜。

用 96 或 24 孔板的盒盖用封口膜封住作为反应板，先铺约 1 ml 抗体稀释液，用反贴法，膜正面向下。注意不能有气泡，可用胶铲或找个干净的试管在膜上滚动去除气泡，再加 0.5 ml 覆盖足够，还可以回收约 1 ml 。回收后的抗体加 0.2% 叠氮钠，保存于 -20 度，可用 1 个月。如果直接放在 4 度，一般一周内使用没问题。

我们一般重复使用 1 次，二抗建议不要重复使用。酶太容易失效了，再说二抗很便宜，别省这点钱。但要注意，要把反应板用另一个对称的 96 或 24 孔板盖子盖好，然后保鲜膜包好，并放在湿盒以防抗体挥发。

建议大家可去收集做 MTT 实验的同学或其他人的 96 或 24 孔板的盒盖，最好找到不同牌子的板子，这样更容易找到两块可以对称盖好的盒盖。

封口膜大约 150 元一卷，做反应板时只要剪一半即可，封口时双手尽量将封口膜向四周拉，然后覆盖盒盖即可，一般我封 3 层，怕破。新手肯定要多练习，我刚开始时，用老大一块膜才封好一层，现在只要四分子一块即可。

蛋白有关

向电泳玻璃板内加入胶条时，先在缝隙中加入配好的溴芬兰缓冲液，要加满，再将胶条贴后面玻璃板壁用薄塑料片将胶条缓缓推下至凝胶上缘，这样可以很好的避免胶条下形成空气泡。

能做出好的图谱已经很不容易了，如果在扫图时撕破实在可惜，所以扫图要小心，将凝胶转移到扫描仪时可以用塑料隔片在下面托着，同时保持有些水，这样就安全多了。

做蛋白修饰巯基实验时，先检测修饰体系是否对方法有影响，修饰基团是否会在 595 nm 和 412 nm 下有特定的吸收。修饰后修饰试剂本身是否会有变化，对蛋白整体结构造成影响。

其次再谈具体修饰比例和程度。对于巯基浓度测定方法，有四种（Anal Biochem. 1998 Dec 1;265(1):8-14），而 DTNB 本身虽然灵敏度不高，但是重复性和抗干扰是最佳的。

蛋白透析的时候透析液的 pH 值很重要。除 pH 值外，做透析操作的时候一定要带手套，手上的一些油脂对透析袋的通透性以及整个透析的效果有很坏的影响。

蛋白透析时出现沉淀总是不可避免的，但是要想尽办法将沉淀降到最低。导致沉淀出现的主要原因就是 pH 值。建议透析前先查一查自己目的蛋白的等电点，然后确定透析液的 pH 值，而且 pH 值最好是离蛋白等电点远一点。一次透析可以配制 3 个不同 pH 值的透析液，这样根据沉淀的多少确定最佳透析 pH 值。

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