CRISPR 研究新思路，你不一定知道

1. CRISPR/Cas 简介

CRISPR-Cas 是细菌和古细菌在自然界生物长期的进化过程中，演化出了一种独特的适应性免疫系统。

在该系统中，一种称之为 Cas 的限制性内切酶能在短链 RNA 的引导下，靶向降解外来入侵的 DNA 或 RNA，人们将这一系统命名为 CRISPR-Cas，即成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关基因 （Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated genes, CRISPRCas）。

回顾以往，这一成簇规律间隔的短回文重复序列于 1987 年首先在大肠杆菌 Escherichia coli 染色体上被发现，然而其蕴藏的生物学意义似乎并没有立即被人们所了解。之后的研究显示，CRISPR 其实在绝大多数细菌和古细菌中都普遍存在。

直到 2005 年，CRISPR 与抗病毒免疫之间的联系才逐渐被人们认识到，随着科学家们的不断发现，直到 2012 年 CRISPR 的相关作用机理被真正的了解清楚，科学家们开始把它应用于基因编辑领域。2013 年，CRISPR-Cas9 开始被作为一种基因编辑技术而被广泛使用。

OriGene 公司也是最早开始研发 CRISPR-Cas9 系统相关分子生物学产品的公司之一，现有产品线覆盖多个研究方向。

多年来，OriGene 研发团队致力于为科研工作者提供更加简单高效稳定的 CRISPR-Cas9 系统产品，提供了多种不同实验思路，根据科研工作者的实际情况提供更加贴近实验需要的产品。

2. 现有的 CRISPR-Cas9 系统实验构建方案

（1）基于 DNA 载体的实验方案

OriGene 提供的 Vectors 通过转染进入细胞后，U6 启动子转录出 sgRNA, Cas9 基因在细胞内需要转录翻译等多个过程才能表达出 Cas9 protein，两者结合在胞内寻找识别目的序列达到基因编辑的作用。

OriGene 为科研工作者提供多种 Vectors 选择方案：

All-in-one: CAS9 表达基因 sgRNA 转录元件在同一载体上?CAS9 Only vectors：只含有 CAS9 表达基因

sgRNA only vectors：sgRNA 转录元件

Lenti vectors：慢病毒载体

Nickase vectors：单链切割载体

（2）基于 sg RNA 和 mRNA Mix 的实验方案

OriGene 提供 sgRNA 设计及人工合成服务，通过将 Cas9 的 mRNA、人工合成的 sgRNA 以及混合体直接转染或者注射到待编辑细胞中来提高筛选效率。

其原理是由于有些细胞难以通过常规转染的方式导入外源 DNA 片段，然而通过此方式可以直接将充足的所需基因编辑元件导入细胞体内，达到基因高效编辑的目的。该方案转染 DNA 进入细胞，避免了 DNA 进入细胞后的发生基因重组的可能。

该方法的另一个重要目的是由于这样避免了 Cas9 在体内的持续表达，从而减少了 Cas9 发挥作用的时间，由此减少脱靶的产生。人工合成 sgRNA 纯度更高，质量更加稳定，实验重复性显着提高，该方法已在隐杆秀丽线虫、多功能干细胞、斑马鱼等模式生物中得到成功使用。

The editing efficiency （solid bars） andconsistency （error lines） of synthetic sgRNAs against invitro transcribed （IVT） guide RNAs in HEK293T cells. The experiment wasconducted by a third-party using three different gene targets and wasreplicated three times.

（3）sgRNA 和 Cas9 protein 复合物的实验方案

OriGene 提供活性验证过的 Cas9 Endonuclease，在胞外将 sg RNA 和 Cas9 Endonuclease 混合后，采用特殊转染方法转染或者显微注射进入细胞发挥作用。这些基因编辑元件进入细胞后可以直接发挥作用，避免细胞周期内其它因素对实验造成干扰，效率更高，实验周期更短。

OriGene Cas9 Endonuclease 活性验证图

3.CRISPR-Cas 未来研发方向

随着科学家们对基因编辑的要求越来越苛刻，CRISPR-Cas 系统也暴露出一些丞待解决的问题，包括精确修复比例低、PAM 限制识别序列、脱靶现象等。CRISPR-Cas 系统的未来研发方向往往通过解决这些问题，让它应用在更多的领域。

CRISPR/Cas9 切断基因组双链 DNA 后，断裂处的修复方式主要是非同源末端连接（non-homologousEnd Joining，NHEJ），这是一种错误率极高的修复方式，读框移码的插入或删除，导致基因功能丧失；而能在目标位点精确插入期望序列的修复方式—同源介导的双链 DNA 修复（homology directed repair，HDR）所占比例非常低。

CRISPR/Cas9 技术若要成为基因治疗的手段之一，必须实现精确定点编辑。研究表明，可通过抑制 NHEJ 修复或者增强 HDR 修复来提高精确修复的效率。

OriGene 的研发团队也一直致力于这方面的研究，并将研究成果变成产品提供给更多的科研工作者，OriGeneGene knockout Kit 2.0（即将上线），便是利用修复手段达到基因敲除的目的，不再需要构建同源序列，极大的缩减了实验流程，提高实验效率。

2015 年，科学家报道了一种新的 2 类 V 型 CRISPR 效应蛋白 Cpf1，是在单链向导 RNA 引导下与靶 DNA 特定位点结合幵切割的核酸内切酶，Cas9 切割 DNA 形成一个平末端；而 Cpf1 切割 DNA 形成一个有 5 个核苷酸突出的黏性末端。

利用 CRISPR/Cas9 迚行基因插入时，需要在插入基因的两端添加较长的同源臂，通过同源重组的斱式将其插入靶位点；而利用 CRISPR/Cpf1 进行基因插入时，若在插入基因的两端添加与靶位点对应的黏性末端，就可以使插入基因通过 NHEJ 修复以可控的斱向插入靶位点，而不必依赖于同源重组，这也不失为一种提高精确编辑的新思路。

OriGene 强大的研发团队也紧随科研潮流，对于 CRISPR/Cpf1 系统的研发从未间断，相信在不久之后 CRISPR/Cpf1 系统产品便会和大家见面，让我们共同期待吧。

PAM 限制识别序列的问题，前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）是一个位于靶 DNA 3' 端的短核苷酸基序，可被 Cas9 蛋白特异性识别。化脓性链球菌可识别标准 PAMNGG 和非标准 PAMNAG。

理论上，生物基因组中 NGG 每隔 8 bp 碱基出现一次；NRG 则每 4 bp 碱基出现一次。但由于不同基因序列上的差异，并非所有的基因都能有合适的 PAM。分析玉米的全基因组，在有注释的外显子中仅 30% 能找到特异性切割位点。这表明，PAM 在一定程度上限制了 Cas9 剪切位点的选择。

为了减弱 PAM 对 Cas9 蛋白的限制，可对 Cas9 蛋白进行改造和使用 Cas9 直系同源酶。有学者主张改造 Cas9 蛋白，扩大其 PAM 的识别范围。化脓性链球菌 Cas9 的多种突变体进行筛选，识别 PAM 的序列变为 NGAN， NGCG，NGC， NGG， NAAG。

这些变更了识别 PAM 的突变体，无疑扩大靶位点的选择。而研究也证实，这些突变体可以在野生型 SpCas9 无法找到编辑序列的斑马鱼和人类内源性基因位点中，找到合适的编辑位点。

也有学者主张利用 Cas9 直系同源酶减弱 PAM 对 Cas9 蛋白靶位点的限制。目前通过序列比对等方法发现 Cas9 的直系同源酶已超过 1000 种，但已确定 PAM 序列的 Cas9 直系同源酶仅有朗西丝菌（PAM 为 NGG）、金黄色葡萄球菌（PAM 为 NGGRRT）、脑膜炎双球菌（PAM 为 NNNNGATT）、嗜热链球菌 CRISPR1（PAM 为 NAAGAAW）、嗜热链球菌 CRISPR3（PAM 为 NGGNG）等少数几种。

意味着 Cas9 直系同源酶是一个巨大的侯选库，可以用于克服化脓性链球菌 Cas9 在一些物种应用上的局限性。为了充分利用 Cas9 直系同源酶，研究者不仅利用生物信息学与 PAM 文库结合的方法确定更多 Cas9 直系同源酶的 PAM 序列，而且对已知 PAM 序列的 Cas9 直系同源酶加以改造。

随着 Cas9 结构生物学研究的不断进展，利用结构生物学知识和蛋白质定向进化方案，更是能够极大地丰富 PAM 序列库，PAM 限制识别序列将不再是问题。

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