应 用 1H-NMR波谱的环境代谢组学研究实验

一、材料

1. 组织收集和保存

（1）液氮和保温瓶。

2. 体液收集和保存

（1） 液氮和保温瓶。

（2）含肝素的血液收集管（如 BD Vacutainer Heparin Tubes)。

3. 使用甲醇-氯仿对组织中极性和亲脂性代谢产物的联合提取

（1）有铝衬黑尿素螺纹盖的直壁玻璃瓶，包 括 「大」（高 X 直 径 为 46 mm X 12. 5mm) 和 「小」（36 mmX 11 mm) 瓶（Fisher Scientific)。

（2）甲 醇（HPLC 级别； Fisher Scientific) : 全过程置于冰上。

（3）氯 仿（杀虫剂分析级别； Fisher Scientific) : 全过程置于冰上。

4. NMR 体液和极性组织提取物的制备

（1）NMR 缓冲液：憐 酸 钠 缓 冲 液（由 NaH2PO4 和 Na2 HPO4 组 成 ； FisherScientific) pH 7.0，用 D2O (99. 9 % 纯度； Goss Scientific Instrument， GreatBaddon,UK) 配制，含 I mmol/L 3 - (三甲基硅烷基)_丙酸-2 ， 2 ， 3 ， 3 , -山 钠（TMSP; 9 8 % 纯度； Goss Scientific Instruments) 作为化学位移标准品内参。室温下保存于干燥器中。

（2）Norell 5 mm NMR 管和帽。

5. NMR 亲脂性组织提取物的制备

（1）氘化 NMR 溶剂： 2 : 1 混合的氯仿-d (CDCl3; 99. 8 % 纯度； Goss Scientific Instruments) 和甲醇-山（CD3OD; 99. 8 % 纯 度 ； Goss Scientific Instruments),含 0 •5 mmol/L 四 甲 基 桂 烧（TMS; 99. 9 % 纯 度 ； Goss Scientific Instruments)作为化学位移标准品内参。室温下保存于干燥器中。

（2）Norell 5 mm NMR 管和帽。

6. 高分辨率 1 H NMR

（1） 500MHz 或 600MHz NMR 波谱仪可用于代谢组学研究。

（2）常规的 NMR 探针，尽管灵敏度较高的 NMR 超低温探头或冷探头是一种绝对的优势。

二、 方法

1. 样本收集和制备

代谢组学生物样本的制备包括三个主要步骤。首先是快速收集并冷冻样本，以猝灭代谢作用并保持代谢产物浓度（见 1.1 和 1.2)。然后样本应保存于一 80°C 来防止代 谢 降 解（18)。第二步只针对组织样本，包括在溶剂存在下机械性地破碎组织，并除去 蛋 白 质（见 1.3)。尽管有很多提取方法可以使用，在此我们推荐可以将极性和亲脂性代谢产物分离为两部分的甲醇-氯仿程序（19)。最后一步将溶液优化用于高分辨率 NMR。对于体液和极性组织提取物，此步包括调整样本的 PH (以最小化 NMR 共振的化学位移差异），加 D2O (以提供一个 NM R 波谱仪的频率锁定）和加人 NM R 化学位移 标 准 品（见 1.4)。对亲脂性组织提取物，此步需要加入氘化溶剂作为频率锁定(frequency lock) 和化学位移标准品（见1.5)。

1.1 组织收集和保存

（1）快速切取组织（理想的为 100 m g 湿重，尽管此处提及的方法已经成功地用于2 0 m g 组织），立即冷冻进液氮碎灭代谢反应。将样本转移到标记的冻存管中并放回液氮或置于干冰里（见注释 1)。

（2） 样本应始终保持在一 80°C (或更低），或者在液氮、干冰或冰箱里。在一 80°C 冰箱里长期保存是最方便的方式。

1.2 体液收集和保存
（1）使用适当的方法收集体液（ 理想情况下 250〜500 ML)，例如用注射器和针头。

（2）对于血液，把每份样本转移到一个含肝素的血液收集管中（见注释 3)。离心除去细胞，然后将血楽样本转移到冻存管中，在液氮或干冰里冻存。

（3）对尿液，将每份样本直接转移到冻存管中然后冻存到液氮或干冰里。

（4）样本应该保存于一 80°C (或更低）。

1.3 使用甲醇-氯仿对组织中极性和亲脂性代谢产物的联合提取

（1）为每个组织样本标记四个玻璃瓶（ 三个小的一个大的）。

（2）将组织样本从冰箱中取出置于干冰上。快 速 称 量 每 份 样 本（理想状态下 100mg)，小心不要让其融化。

（3） 加 4 mL/g (湿重）冰甲醇和0.85 mL/g 冰去离子水到一个大的玻璃瓶中，加入第一个组织样本，然后用匀浆器匀浆 5〜10 s。

（4）加 2 mL/g 冰氯仿到匀浆的样本中，漩涡混勻 30 s ，然后置于冰上。对所有样本重复此过程。

（5）使用轨道振荡器在冰上振荡所有样本 l 〇 min 。所有溶液都必须单相（见注释 4)。

（6） 4° C 下 1800 g■离心样本 5 min。将每份上清转移到一个小玻璃瓶中。

（7） 加 2 mL/g 氯仿和 2 mL/g 去离子水到每份样本中（见注释 4 和 5 ) 并漩涡混匀30 s

（8） 4°C 下 1800 g离心样本 l 0 min 。溶液会分散为上层的甲醇-水相（极性代谢产物）和下层的氯仿相（亲脂性复合物），中间为一薄层的细胞碎片。

（9）用两个有金属针头的 Hamilton 注射器，转移每个样品的上层和下层到小玻璃瓶中（见注释 6)。

（10）使用快速真空浓缩仪从所有样品中除去溶剂，然后保存在-80℃ 直至使用。

1.4 N M R 体液和极性组织提取物的制备

(1)对于干燥的极性组织提取物（来 自 3.1.3 中的甲醇相），在 550 uL N M R 缓冲液中重悬样本，然后漩涡混合 1Os (见 注 释 7)。在这个例子中 ， NM R 磷酸盐缓冲液浓度应该是 100 mmol/L 。

(2)对于体液，每 300 fxL 样 本 和 300 NMR 缓冲液混合，漩 涡 混 合 l0s。在这里 ，开 始 NMR 磷酸盐缓冲液浓度应该是 200 mmol/L , 因此稀释后浓度是 100mmol/L 。

(3)室温下， 12 OOOg 离 心 5 min。

(4)转移 520uL 到每个标记好的 NMR 管中。

1.5 N M R 亲 脂 性 组 织 提 取 物 的 制 备

（1）在 550 uL 氘化的 NMR 溶剂中重悬亲脂性组织提取物（来 自 3 中干燥的氯仿相），并漩涡混合 10 s。

（2）室 温 下 IOOOg 离 心 5 min。

（3）转移 520 uL 到 每 个 标 记 好 的 NMR 管中。

2. 高分辨率 1 H-NMR

NMR 波谱仪是使用前需相当的操作训练的专门化的分析仪器。此处描述的方法假定操作者已有 NM R 的基本工作知识。有 很 多 公 司 生 产 NM R 系统 ，包 括 Bmker BioSpin、 JEOL 和 Varian, 以下描述的方法在 Bruker 系 统 中 效 果 最 佳（Xif 此系统编者有最丰富的经验)。当然这些方法可以直接用于其他 NMR 系统。 2.1 和 2.2 描述了
环境代谢组学使用的详细一维（I-D) 和 二 维（2-D) NMR 试 验 ，包括每种方法的优点和缺陷。数据收集前常用的一般的样本最优化策略在 2. 2 中 描 述（见 注 释 8)。

（1）将 5 mm 的 NMR 管载入波谱仪中。

（2）设定样品温度为 300 K 并让溶液在波谱仪中热平衡几分钟（见 注 释 8)。

（3）转动并匹配 NMR 探针。

（4）锁定谱仪频率到由 NMR 溶 剂 产 生 的 氘 共 振 频 率 上（分析体液或极性组织提取物时锁定到 D2O , 或者对于非极性组织提取物锁定到 CDCl3)。

（5）用自动的方法垫补好样品（见 注 释 9)。

（6）确定 NMR 谱中一个 360°圆锥角峰的脉冲持续时间，由 此 60°和 90°的圆锥角可以很容易地计算出来。

（7） 确定水共振的频率并将波谱的中心设定到这个频率上。

2.1 标 准 1 维 ¹ H-NM R 试 验

辑，也是依赖于样品的类型（见注释 11)。

(2)过程参数： M K 数据点填零；使 用 〇.5 Hz 的指数线加宽；使用傅里叶变换，手动 相 波 谱（零和第一顺序校正）；用多项式函数手动校正基线；设 定 TM SF 或TM S 峰到 0. 0 ppm 来校准波谱。

(3) 使用以上的参数记录并处理数据。

(4)计算 2-D 谱 的 I-D 地平线投影（p-JRES)。

3. NMR 代谢组学数据的分析

现有两种相关的分析 NMR 代谢数据的策略。这两种策略可分为传统的指纹技术(3.1) 和新的模式法（3.2)。

3.2 基 于 模 式 法 的 NM R 代谢组学数据分析

（1）模式法是分析 NMR 数据更具有计算挑战性的方法，而且是基于每个 NMR 谱峰转化为一系列代谢产物及它们的浓度。因为一个 NMR 波谱里峰的化学位移会因样品 pH、温度和其他的「基质效应」而波动，目前用完全自动的方法准确地鉴别和量化 I-D NMR 谱里的代谢产物还是不可能的。仍然需要一些人工介入来指导去转化程序。 一 个 基 于 I-D NM R 代谢数据模式法分析法的领先软件是Chenomx NMR Suite 软 件（Chenomx, Edmonton, Canada) , 该软件现在可以使用有 240 个代谢波谱的库来鉴定和量化体液中的代谢产物。

（2）波谱转化后，可直接对这些数据使用与 3.1 中相同的多参数统计分析方法(例如 PC A 和 PLS)。这种模式法的优点是多参数分析的结果对生物学家来说相对更有意义，因为其是由代谢物鉴别结果组成而非未鉴定的峰。很明显这种信息更加有用，并且可以用于生物标志物发现、鉴定特定代谢途径的作用，以及非仪器依赖的数据归档。

（1）当切取很多样品时，最快的方法是将切过的样品直接放入冻存管中然后马上放人液氮。

（2）样品可以保存数月。例如，迅速冻存并且保持于一 80°C 的血浆样品，保 存 9 个月后仍未见明显的代谢改变 （18)。

（3）不要使用 E D T A ，作为抗凝血剂，它会在 N M R 谱中产生干扰峰。

（4） B lig h 和 Dyer ( 2 3 ) 确定溶液的体积应该遵循以下比例：代谢产物提取的单相溶液： 2 : 1 : 0.8 的甲醇-氯仿-zK; 分离成分的双相溶液： 2 : 1 : 1.8 的甲醇-氯仿-水。水的总体积还包括组织中水的体积加上增加的去离子水的体积。

（5）为了将极性脂类（磷脂）更好地分配到氯仿层中，可以通过用 0 . 8 % 的 K C l 水溶液代替水来提高甲醇相的极性。

（6）所有样品的处理和保存必须在玻璃容器中进行，因为氯仿能溶解塑料管和移液器吸头上的化合物，从而污染 N M R 谱 。

（7）如果提取物仅来自于甲醇-氯仿提取，漩涡混匀后将样品从玻璃瓶中转移到 Eppendorf 管中。

（8）理想情况下，在一个特定的代谢组学研究中，所有的样品应该使用一致的提取方法、 N M R 缓 冲 液 和 N M R 管中溶液的体积。在此情况下，可减少很多对N M R 谱仪中每个样品的优化程序。详细说来，只有步骤 1、 2、 4 和 5 是需要的，最优化的质量可用注释 9 中的标准校验。

（9）垫补的质量，用 T M S P 或 T M S 的半峰全宽衡量，应该在 2. 0 H z 以 下（在切趾法导致任何线加宽之前)。

（10） 对于包含卯％ 〜100% 氘化溶剂的样品（例如来自组织提取），可用基本的水预饱和来抑制残余水共振。然而，对于含高百分比 H 2O 的体液样本，必须使用更加有力的水抑制技术。

（11）如果标准 I-D 1 H -N M R 谱展现了宽阔的共振频率（来自高分子质量的大分子和动态抑制的化合物），那么可以使用更正过的脉冲序列，以更有利于自由的、低分子质量代谢产物的观察。这在分析血浆样本中经常是必需的。所 需 的脉冲序列叫做 1 H Carr-Purcell-Meiboom-Gill (C P M G ) 自旋回波 N M R 序列。