流式实验如何配色？
Elabscience
第一步、根据实验目的，选择目标 Marker。
通过阅读相关文献，了解您实验需要选择哪些 Marker，以及这些 Marker 之间的逻辑关系（圈门的父子关系，比如 T 细胞CD3 是「父」，而 CD4 或者 CD8 就是子」）。
这里列举了一些常见的细胞标志 Marker：
第二步、确认 Marker 的表达位置。
对于细胞质或者细胞核的 Marker，需要对细胞进行固定破膜/破核膜。在做胞质或胞核 Marker 染色实验操作时，需要先染细胞表面 Marker，再对细胞进行固定破膜，最后对胞内或核内 Marker 染色。此时细胞表面的 Marker 尽量避免使用串联染料，因为「固定」容易对串联荧光素造成影响。
一般来说，绝大部分 CD 分子指标，都是细胞表面指标；IL 白介系列、IFN-γ、TNF-α 等，属于胞内指标；而最常见的核内染色指标是 Foxp3。
确认 Marker 表达位置的同时，我们还需要了解 Marker 的表达量。流式配色基本原则第一条是「强弱搭配」，我们需要通过表达量的强弱，来搭配荧光素的弱强。
通常，根据待测细胞类型中，相应抗原的表达量，可以粗略地将抗原分子分为三类：
1. 很容易鉴定、容易区分阴阳性细胞群、阴阳性峰明显分开的抗原。例如：CD3，CD4，CD19 等。
2. 很容易鉴定、较高水平表达、经常连续性表达。例如：CD27，CD28，CD45RA, CD45RO 等。
3. 低水平表达、激活性 Marker、未知但关键。例如：CD25，STAT5，Foxp3 等。
表达量的强弱，可以参考厂家的质检结果，但更多地需要参考文献里具体细胞群体的表达。
第三步、了解实验所用流式细胞仪的配置信息，包括：流式细胞仪的激光器、检测通道和滤光片等。
上期提到：流式细胞仪是同时检测多种荧光的，这些荧光之间可能存在干扰。我们需要根据流式细胞仪的通道，来确认有哪些荧光素可以选择，这样可以在后期搭配的时候，尽量避免干扰。如果没有仪器的通道信息，是无法去确定哪些荧光素可供选择的。可以说，如果没有仪器通道信息，配色就是「无源之水，无本之木」。
通过仪器通道信息，确认可以选择哪些荧光素后，我们还需要了解荧光素的信息，确认这些荧光素的激发波长和发射波长、接收该荧光的滤光片等信息，是否和流式细胞仪的通道一致。
第四步、了解荧光素的强度。
下表列出了常见荧光素的强度：
在已确定 Marker 的强弱，和流式细胞仪可检测的荧光素的强弱后，我们要遵循「强弱搭配原则」，进行配色。
强表达抗原，可以选择弱荧光素，也可以选择强荧光素。
如下图所示，强表达抗原 CD3，选择弱荧光素 FITC 或强荧光素 APC，对实验结果影响不大。
弱表达抗原，一定要选择强荧光素。
如下图所示，弱表达的抗原 CD25，选择弱荧光素 PerCP，会导致阴阳性细胞群分不开。如果选择强荧光素 PE，可以看到明显的阳性细胞群。
当然，有些老师在配色时，也会遇到一些其他的问题，如：细胞样本有自发荧光、细胞处理容易出现死细胞（需要额外增加死活细胞染料）等。因此，我们需要特别注意，将对应通道的荧光检测信息，预留给自发荧光，或者死活染料检测。相信在了解了流式配色的基本原则及操作步骤后，大家的实验也能更加顺利地开展啦~
