施一公团队又出新作！进一步解析人类 U2 snRNP 组装过程，提供癌症突变机制新见解
丁香学术
导读
pre-mRNA 的剪接是由一种被称为剪接体的大而动态的 RNA-蛋白质复合物执行的。剪接体由 5 个小的核糖核蛋白颗粒（snRNPs，包括 U1、U2、U4、U5 和 U6）和非 snRNP 因子组装而成。每个 snRNP 由一个单独的小核 RNA (snRNA)，7 个常见的 Sm 蛋白和一些特定的蛋白质因子构建。在这 5 个 snRNP 中，U2 snRNP 在内含子的识别和前体折叠的组装过程中起着重要作用。
人类的 U2 snRNP 尤其复杂，它的组装是一个多步骤的过程，并且人们对此知之甚少。17S U2 被认为是直接参与早期剪接体组装的人类 U2 snRNP 的功能形式。17S U2 snRNP 的核心成分包括 SF3b 配合物、SF3a 配合物、12S U2 核心、剪接因子 TAT-SF1 和 DDX46。体外实验也表明，SF3b 与 12S U2 核依次组装，形成一种被称为 15S 粒子的中间产物，最终形成 SF3a 复合物。然而，对组装这一过程的蛋白质因子却知之甚少。
最新的研究表明，具有 RNA 伴侣活性的 DDX42 可能是在 U2 snRNP 组装完成后释放的。而与 DDX42 相反，DDX46 是 17S U2 的一个组成部分，在剪接前体的组装和分支位点的校对过程中发挥着重要作用。但 DDX46 是否在 U2 snRNP 组装中有额外的作用尚不清楚。此外，虽然 DHX15 在内含子-套索剪接体 (ILS) 复合体分解中的机制已被广泛了解，但其在 U2 snRNP 和早期剪接复合体中的作用仍不清晰。
要解决这些关键问题，就必须阐明这些 RNA 解旋酶的结构和功能。最近的研究既揭示了 17S U2 snRNP 的整体结构，也揭示了 SF3B1 与 DDX46 之间的详细相互作用，但 DDX42 和 DHX15 在早期剪接复合体中的结构信息仍然缺乏。
2023 年 2 月 17 日，西湖大学施一公及张晓峰团队在 Nature Communications 杂志发表了题为 Mechanisms of the RNA helicases DDX42 and DDX46 in human U2 snRNP assembly 的文章，报道了 DDX42-SF3b 配合物的高分辨率结构和含有 DDX42 的 17S U2 snRNP 的假定组装中间体 (以下简称 DDX42-U2 配合物)。此外，他们还分离出一种含有 DHX15 的 U2 snRNP。
他们的研究结果揭示了 SF3B1 与 DDX42、DDX46 和 pre-mRNA 的多嘧啶束 (polypyrimidine tract, PPT) 相互作用的共同模式。结合生化分析，他们还揭示了 DDX42 和 DDX46 在 U2 snRNP 组装中的作用，并为 SF3B1 突变导致的癌症提供了新的见解。
图片来源：Nature Communications
主要研究结果
样品制备及结构测定
首先，研究人员纯化了 DDX42-SF3b 复合物以及含有 DDX42 的潜在剪接体复合体。在 DDX42 的 N 端融合了一个 Flag 标记，并利用该标记对内源性复合体进行亲和选择。纯化后的样品在交联条件下进行梯度离心。最终样本只包含 5 种 snRNA 中的 U2。经过 2D 和 3D 分析，人类 DDX42-U2 复合体最终被重建，平均分辨率为 2.7 Å。
使用类似的策略，他们在 DHX15 上使用 Flag 标签拉下内生剪接复合物。经过亲和选择和梯度离心，他们分离出一个包含 DHX15、U2 snRNA 和 17S U2 snRNP 的大部分蛋白质成分的大分子复合物 (称为 DHX15-U2 复合物)，该复合物显示了与 17S U2 snRNP 相似的结构特征。
图片来源：Nature Communications
DDX42 锚定在 SF3b 复合物上
在 DDX42-SF3b 复合物中，SF3B1、SF3B3、SF3B5 和 PHF5A 的构象与游离 SF3b 配合物的构象几乎相同。DDX42 结合在 SF3b 核心的外围，并主要通过其 N 端扩展序列锚定在核心上。与这些序列基序相反，DDX42 的解旋酶结构域由两个 RecA 结构域组成，松散地连接在 SF3B1HEAT 的 C 端。
DDX42- SF3b 接口最显著的特点是将 DDX42 N-plug 放置在 SF3B1 的表面凹槽区域中，来自 N-plug 的带负电荷的氨基酸与来自 HR4-HR9 的带正电荷的残基形成了氢键 (H 键) 网络。与 N-plug 相反，DDX42 的 a−3 螺旋通过 SF3B1 的 HR5 与 HR3 的外部结合。
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DDX42-U2 复合物的整体结构
DDX42-U2 复合物的整体结构与 17S U2 snRNP 相似，它们都表现出二级结构，3' 结合域灵活地连接到 5' 端。与 17S U2 相比，DDX42-U2 复合体中 SF3b、SF3a 和 U2 snRNA 的构象几乎相同。此外，TAT-SF1 的 UHM 结构域与 U2 snRNA 的 Linker 结构域在 DDX42-U2 复合物的结构中缺失。
与 DDX42-SF3b 配合物相比，DDX42 的 N 端序列，包括 N-plug 和螺旋结构，仍然与 SF3B1 结合，但解旋酶结构域已从 SF3B1HEAT 的 c 端移位。因此 DDX42 解旋酶结构域在 DDX42- U2 复合物中的确切位置尚不清楚。
DDX42-SF3b 与 DDX42-U2 的结构叠加显示了 DDX42 的解旋酶结构域与 U2 snRNA 之间的重叠位置。此外，DDX42 的解旋酶结构域也与 TAT-SF1 的 Linker 结构域重叠，这有助于维持稳定构象。TAT-SF1 的连接子结构域主要与 SF3B1HEAT 的 HR16 和 HR17 残基相互作用，这些相互作用可能在 DDX42 的解旋酶结构域从 SF3B1 取代的过程中起着至关重要的作用。
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DDX42 和 DDX46 竞争性结合 SF3b
将 DDX42- SF3b 和 DDX42-U2 与先前报道的 17S U223 和组装剪接体进行结构比较，发现 SF3B1 的 RNA 路径依次被三个结构基序占据：DDX42- SF3b 和 DDX42-U2 中 DDX42 的 N-端、17S U2 中 DDX46 的酸性环以及组装剪接体中 pre-mRNA 的聚嘧啶束。此外，DDX42 和 DDX46 的 N 端序列在 SF3B1 的凸面上共享额外的锚定位点。因此，SF3B1 释放 DDX42 是 17S U2 snRNP 成熟期间 DDX46 募集的先决条件。从这个意义上说，DDX42 和 DDX46 都充当 RNA 路径的伴侣，并保留其参与下一个相互作用伴侣的功能。
为了促进对 DDX42 和 DDX46 的机制理解，他们使用生物层干涉术定量测量了它们与 SF3b 复合物的相互作用。DDX42 和 DDX46 对 SF3b 配合物分别表现出 23 nM 和 66 nM 的明显结合亲和力。由于 DDX42 和 DDX46 都占据了 SF3B1 的 RNA 通路，因此预测它们在与 SF3b 的结合方面具有竞争力。当大量过量供应 DDX46 时，DDX42 从预组装的 DDX46-SF3b 复合物中取代 DDX46，形成 DDX42-SF3b 复合物。类似地，大量过量的 DDX46 也能够从 DDX42-SF3b 复合物中取代 DDX42，这种竞争性结合可能最终促进 17S U2 snRNP 的成熟。
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结语
综上所述，在这项研究中，他们发现 DDX42 与 SF3b 自发结合，形成 DDX42-SF3b 复合物，然后招募 12S U2 核心粒子和 SF3a 组装 DDX42-U2 配合物。虽然 DDX42 活性的靶点尚不清楚，但他们得到的结构数据表明，DDX42 可能在 U2 snRNA 在 SF3B1 上的调节过程中发挥重要作用。
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SF3B1 的体细胞突变导致调控异常的 RNA 剪接，并在多种癌症中观察到。与 DDX42 或 DDX46 相互作用的 SF3B1 残基被分为三类：仅与 DDX42 相互作用，仅与 DDX46 相互作用，以及与两者同时作用。有趣的是，仅与 DDX42 相互作用的 SF3B1 残基不会受到癌症衍生突变的影响；与 DDX42 相反，仅与 DDX46 相互作用的三个 SF3B1 残基 (Asp894, Tyr898 和 Glu902) 在癌症中发生突变。此外，与 DDX46 和 DDX42 相互作用的 7 个 SF3B1 残基是癌症突变的靶点，包括最常见的突变残基 Lys700。因此，本研究的结果为 SF3B1 突变所致癌症的机制提供了新的见解。
题图来源：站酷海洛
参考文献：
1. Yang, F., Bian, T., Zhan, X. et al. Mechanisms of the RNA helicases DDX42 and DDX46 in human U2 snRNP assembly. Nat Commun 14, 897 (2023).
2. Tholen, J., Razew, M., Weis, F. & Galej, W. P. Structural basis of branch site recognition by the human spliceosome. Science 375, 50–57 (2022).
3. Zhang, Z. et al. Structural insights into how Prp5 proofreads the pre-mRNA branch site. Nature 596, 296–300 (2021).
