施一公团队再获新进展！解析人类 pre-tRNA 剪接机制，完善剪接体结构「地图」
丁香学术
长久以来，剪接体的调控机理是怎样的，它们在细胞内部的动态组合和变化是怎样的，深深地吸引着科学家们的研究兴趣，但其神秘的面纱一直未被揭开。
2023 年 4 月 6 日，西湖大学施一公团队在 Molecular Cell 杂志发表研究论文 Structural basis of pre-tRNA intron removal by human tRNA splicing endonuclease，该研究首次解析了人类 tRNA 剪接内切核酸酶（TSEN）在催化前和催化后状态下与全长 tRNA 前体 (pre-tRNA) 结合的低温电子显微镜结构，显示了 TSEN 如何识别 pre-tRNA，并将 3' 剪接位点和 5' 剪接位点定位到其切割位点，综合利用结构生物学和生化工作解释了人类 TSEN 去除 pre-tRNA 内含子的分子机制。
图 1：来源 Molecular Cell
研究内容
转运 RNA（tRNA）对生物遗传信息的传递至关重要，它通过核糖体将信使 RNA（mRNA）翻译成蛋白质。成熟的 tRNAs 由前体 tRNAs（pre-tRNAs）通过一系列的转录后加工和修饰步骤产生，从 pre-tRNA 中去除内含子对于生物遗传进化是必不可少的。
在人类中，去除 pre-tRNA 中内含子的过程是由 tRNA 剪接内切核酸酶（TSEN）介导的，该亚酶包括四个亚基：TSEN2、TSEN15、TSEN34 和 TSEN54。值得一提的是，尽管多核苷酸激酶 CLP1 在体外对前 tRNA 切割是可有可无的，但 CLP1 中的突变和所有 TSEN 亚基都与 tRNA 代谢和神经病理学的改变有关。
为回答 pre-tRNA 是如何被 TSEN 识别的，以及 5' 剪接位点和 3' 剪接位点是如何被加载到 TSEN2/ TSEN34 的活性位点这两个困扰科研界多年的谜题，本研究通过纯化人 TSEN/CLP1 复合物、pre-tRNA 切割试验、TSEN/CLP1/前 pre-tRNA 复合体的组装、冷冻电镜样品制备和数据采集以及竞争性结合测定生化实验，对其进行深入探索。
图 2：来源 Molecular Cell
研究结果
本研究首次报道了两种人类 TSEN 与全长 pre-tRNA 结合、高分辨率低温电子显微镜结构：一种在催化前状态，另一种在催化后状态，平均分辨率分别高达 2.94 Å 和 2.88 Å。
研究结果显示人类 TSEN 的结构特征是一个延伸的表面凹槽，容纳了 l 形的 pre-tRNA，pre-tRNA 的成熟结构域被 TSEN34、TSEN54 和 TSEN2 的保守结构元件所识别，这种识别定位了 pre-tRNA 的反密码子茎。
图 3：来源 Molecular Cell
令人惊喜的是，5' 剪接位点和 3' 剪接位点周围的核苷酸主要被 TSEN2 和 TSEN34 识别，这些相互作用可以确保 5' 剪接位点和 3' 剪接位点分别精确地放置在 TSEN2 和 TSEN34 的催化中心中。
此外，为了捕获预催化状态，研究人员在 TSEN 中引入了两个错义突变：TSEN34 中的 H255A 和 TSNE2 中的 H377A，进而研究其结构信息以及结构引导的生化分析，为成功解析人类 TSEN 前 tRNA 识别和切割的机制提供了基础。
考虑到 pre-tRNA 和 tRNA 结构的相似性，TSEN 延伸的扩展表面凹槽也应该识别 tRNA。为证实该分析，tRNAARG-UCU 与 TSEN/CLP1 形成了一个稳定的复合物。与 tRNA 相比，pre-tRNA 可以被 TSEN 识别，其更具体的相互作用指向其独特的 BHL 基序。
上述结果充分地解释了为什么大部分的内含子序列与 TSEN 没有直接的相互作用，而不同内含子的 pre-tRNA 可以被容纳和裂解，解析了人类 TSEN 去除 pre-tRNA 内含子的分子机制。
图 4：来源 Molecular Cell
研究展望
值得一提的是，施一公及张晓峰团队于两个月前发表研究论文 Mechanisms of the RNA helicases DDX42 and DDX46 in human U2 snRNP assembly，揭秘三种 RNA 解旋酶作用机制——人 U2 snRNP 组装中 RNA 解旋酶 DDX42 和 DDX46 的作用机制，为癌症突变机制提供新见解！
施一公院士团队是世界上首个、也是唯一一个成功捕获并解析了 RNA 剪接过程中所有完全组装剪接体高分辨率三维结构系列成果的团队。从组装到被激活，从两步转酯反应发生到剪接体的解聚，各种各样状态的剪接体完整覆盖了剪接通路，首次将剪接体介导的 RNA 剪接过程完整地串联起来，为理解 RNA 剪接的分子机理提供了最清晰、最全面的结构信息，成功获取剪接体这颗分子生物学皇冠上的明珠。
图 5：剪接体结构汇总（来源：https://ygshi.org/research）
目前，施一公团队克服巨大的技术障碍，深入探索生命细节，获得人类 TSEN/CLP1/pretRNA 复合物在催化前和催化后状态下的结构，为理解 pre-tRNA 剪接的机制提供了一个全新的框架。如此振奋人心的研究结果令人看到了科学家们孜孜不倦的努力，从基础科学的研究到临床应用，再到治疗疾病，未来可期！
题图来源：站酷海洛
参考文献：
1. Zhang et al., Structural basis of pre-tRNA intron removal by human tRNA splicing endonuclease, Molecular Cell (2023), https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.03.015
2.Yang F, Bian T, Zhan X, et al. Mechanisms of the RNA helicases DDX42 and DDX46 in human U2 snRNP assembly. Nat Commun. 2023;14(1):897. Published 2023 Feb 17. doi:10.1038/s41467-023-36489-x
长久以来，剪接体的调控机理是怎样的，它们在细胞内部的动态组合和变化是怎样的，深深地吸引着科学家们的研究兴趣，但其神秘的面纱一直未被揭开。
2023 年 4 月 6 日，西湖大学施一公团队在 Molecular Cell 杂志发表研究论文 Structural basis of pre-tRNA intron removal by human tRNA splicing endonuclease，该研究首次解析了人类 tRNA 剪接内切核酸酶（TSEN）在催化前和催化后状态下与全长 tRNA 前体 (pre-tRNA) 结合的低温电子显微镜结构，显示了 TSEN 如何识别 pre-tRNA，并将 3' 剪接位点和 5' 剪接位点定位到其切割位点，综合利用结构生物学和生化工作解释了人类 TSEN 去除 pre-tRNA 内含子的分子机制。
图 1：来源 Molecular Cell
研究内容
转运 RNA（tRNA）对生物遗传信息的传递至关重要，它通过核糖体将信使 RNA（mRNA）翻译成蛋白质。成熟的 tRNAs 由前体 tRNAs（pre-tRNAs）通过一系列的转录后加工和修饰步骤产生，从 pre-tRNA 中去除内含子对于生物遗传进化是必不可少的。
在人类中，去除 pre-tRNA 中内含子的过程是由 tRNA 剪接内切核酸酶（TSEN）介导的，该亚酶包括四个亚基：TSEN2、TSEN15、TSEN34 和 TSEN54。值得一提的是，尽管多核苷酸激酶 CLP1 在体外对前 tRNA 切割是可有可无的，但 CLP1 中的突变和所有 TSEN 亚基都与 tRNA 代谢和神经病理学的改变有关。
为回答 pre-tRNA 是如何被 TSEN 识别的，以及 5' 剪接位点和 3' 剪接位点是如何被加载到 TSEN2/ TSEN34 的活性位点这两个困扰科研界多年的谜题，本研究通过纯化人 TSEN/CLP1 复合物、pre-tRNA 切割试验、TSEN/CLP1/前 pre-tRNA 复合体的组装、冷冻电镜样品制备和数据采集以及竞争性结合测定生化实验，对其进行深入探索。
图 2：来源 Molecular Cell
研究结果
本研究首次报道了两种人类 TSEN 与全长 pre-tRNA 结合、高分辨率低温电子显微镜结构：一种在催化前状态，另一种在催化后状态，平均分辨率分别高达 2.94 Å 和 2.88 Å。
研究结果显示人类 TSEN 的结构特征是一个延伸的表面凹槽，容纳了 l 形的 pre-tRNA，pre-tRNA 的成熟结构域被 TSEN34、TSEN54 和 TSEN2 的保守结构元件所识别，这种识别定位了 pre-tRNA 的反密码子茎。
图 3：来源 Molecular Cell
令人惊喜的是，5' 剪接位点和 3' 剪接位点周围的核苷酸主要被 TSEN2 和 TSEN34 识别，这些相互作用可以确保 5' 剪接位点和 3' 剪接位点分别精确地放置在 TSEN2 和 TSEN34 的催化中心中。
此外，为了捕获预催化状态，研究人员在 TSEN 中引入了两个错义突变：TSEN34 中的 H255A 和 TSNE2 中的 H377A，进而研究其结构信息以及结构引导的生化分析，为成功解析人类 TSEN 前 tRNA 识别和切割的机制提供了基础。
考虑到 pre-tRNA 和 tRNA 结构的相似性，TSEN 延伸的扩展表面凹槽也应该识别 tRNA。为证实该分析，tRNAARG-UCU 与 TSEN/CLP1 形成了一个稳定的复合物。与 tRNA 相比，pre-tRNA 可以被 TSEN 识别，其更具体的相互作用指向其独特的 BHL 基序。
上述结果充分地解释了为什么大部分的内含子序列与 TSEN 没有直接的相互作用，而不同内含子的 pre-tRNA 可以被容纳和裂解，解析了人类 TSEN 去除 pre-tRNA 内含子的分子机制。
图 4：来源 Molecular Cell
研究展望
值得一提的是，施一公及张晓峰团队于两个月前发表研究论文 Mechanisms of the RNA helicases DDX42 and DDX46 in human U2 snRNP assembly，揭秘三种 RNA 解旋酶作用机制——人 U2 snRNP 组装中 RNA 解旋酶 DDX42 和 DDX46 的作用机制，为癌症突变机制提供新见解！
施一公院士团队是世界上首个、也是唯一一个成功捕获并解析了 RNA 剪接过程中所有完全组装剪接体高分辨率三维结构系列成果的团队。从组装到被激活，从两步转酯反应发生到剪接体的解聚，各种各样状态的剪接体完整覆盖了剪接通路，首次将剪接体介导的 RNA 剪接过程完整地串联起来，为理解 RNA 剪接的分子机理提供了最清晰、最全面的结构信息，成功获取剪接体这颗分子生物学皇冠上的明珠。
图 5：剪接体结构汇总（来源：https://ygshi.org/research）
目前，施一公团队克服巨大的技术障碍，深入探索生命细节，获得人类 TSEN/CLP1/pretRNA 复合物在催化前和催化后状态下的结构，为理解 pre-tRNA 剪接的机制提供了一个全新的框架。如此振奋人心的研究结果令人看到了科学家们孜孜不倦的努力，从基础科学的研究到临床应用，再到治疗疾病，未来可期！
题图来源：站酷海洛
参考文献：
1. Zhang et al., Structural basis of pre-tRNA intron removal by human tRNA splicing endonuclease, Molecular Cell (2023), https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.03.015
2.Yang F, Bian T, Zhan X, et al. Mechanisms of the RNA helicases DDX42 and DDX46 in human U2 snRNP assembly. Nat Commun. 2023;14(1):897. Published 2023 Feb 17. doi:10.1038/s41467-023-36489-x
