Annexin V 凋亡试剂盒常见问题

Q：Annexin V 凋亡检测试剂盒的原理是什么？

A：Annexin V 是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸 PS 有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的 PS 与凋亡早期细胞胞膜结合，将 Annexin V 标记荧光染料如 FITC 利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡。

碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)或 7-AAD 可与双链 DNA 特异性结合，并产生强烈的荧光，正常情况下无法透过细胞膜。由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性，核染料 PI 或 7-AAD 可进入细胞内对 DNA 进行染色，与 Annexin V 搭配使用，可区分处于不同凋亡时期的细胞。

Q：Annexin V 凋亡检测结果如何看？

A：

1. Annexin V^-PI^- —真正的活细胞，Annexin V 和 PI 都无法染上；
2. Annexin V⁺PI^- —细胞只有PS外翻，细胞膜完整，PI 无法染上，此时的细胞为早期凋亡细胞，如果撤走凋亡诱导条件，凋亡可能逆转；
3. Annexin V⁺PI⁺ —PS外翻，细胞膜已经受损，PI 染料可以进入细胞内与 DNA 结合，此时细胞为晚期凋亡或坏死细胞，凋亡不可逆；
4. Annexin V^-PI⁺ —细胞发生机械损伤，PI 可以进入细胞，PS 没有外翻，Annexin V 无法染上或者细胞失去细胞膜成为裸核细胞；

Q：如何统计凋亡细胞数？

Annexin V 凋亡实验在做凋亡统计时一般统计细胞早期凋亡率，也有文献统计总的凋亡比例（早期凋亡和晚期凋亡或坏死细胞之和）。

Q：血液样本是否可以用于凋亡检测？

A：如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有 PS，能与 Annexin-V 结合，从而对实验结果产生干扰。

Q：检测凋亡用的细胞能否固定？

A：甲醛固定液会造成结果假阳性，因此用于 Annexin V 凋亡检测的细胞不能进行固定。

需要注意的是，Annexin V 检测的样本为外周血时，勿使用含有多聚甲醛等固定液成分的红细胞裂解液来处理细胞。

Q：有没有更好的办法处理贴壁细胞，来做流式凋亡实验？

A：检测贴壁细胞时，若消化时间不易控制，建议用 Accutase 细胞消化液，对细胞损伤小且不会改变细胞膜上 PS 的分布。

Q：Annexin V 系列有很多种不同组合试剂盒，该如何选择？

A：第一步考虑流式细胞仪配置，第二步考虑细胞自发荧光。对于本身有荧光的细胞（如转染了荧光蛋白基因的细胞或者药物孵育的细胞），特别是培养时间久或药物处理的细胞，一定要注意细胞代谢物和药物的荧光。一般来说，细胞代谢物的荧光会干扰 FITC/PE，所以建议用 Annexin V-APC，药物的干扰可查看药物本身的发射光谱是否会对检测选择的染料有影响。

Annexin V-APC 与 7-AAD 两种染料之间补偿干扰很小，染色操作简单，实验准确。

7-AAD 染料相比于 PI 染料粘稠度小，可减少检测时样本之间干扰。

Q：说明书上写细胞量为 1~5 × 10⁵ ，细胞量多的话对检测结果有没有影响？

A：建议细胞量最多不要超过 10⁶个，过量的细胞相当于染料被稀释，影响染色和分离效果。一般 2×10⁵ 个细胞足够进行凋亡检测了，通常情况下检测 10,000 个细胞就能得到比较好的结果。

Q：是否可以用 PBS 替代凋亡试剂盒里面的 Binding Buffer？

A：不行，Binding Buffer 是必须要加的，Annexin V 与 PS 的结合依赖 Ca²⁺，Binding Buffer 含有 Ca²⁺，主要是促进Annexin V 与 PS 的结合。不加 Binding Buffer，会导致 Annexin V 的结合能力降低，造成阳性信号大幅下降甚至无阳性信号。

Q：如何设置补偿管？

A：实验设计时，考虑到补偿，建议设置全单染管调节补偿，如果样本有明显的自发荧光，且自发荧光对选择的染料有干扰，则必需设置一管只有自发荧光的细胞管(对于表达荧光蛋白的细胞，不加任何试剂的空白对照组作为EGFP的单阳组；对于有荧光的药物，细胞只加药物处理，作为药物的单阳组)，用来调节补偿，以扣除自发荧光对其它通道的干扰。

Q：染色完不能及时上机，样本能否固定？

A：细胞染色完成后，禁止固定，尽快检测，如无法立即检测，可将样本管放冰上，以减少外界环境对检测结果的影响，Annexin V 结合不稳定，请务必在标记结束后半小时内检测。

如果实验室距离上机的地方较远，建议将细胞和试剂盒带到上机的地方，染色后立即检测。

Q：凋亡检测中如何设置对照组？凋亡检测时细胞全部检测都是阳性是什么原因？

A：Annexin V 凋亡检测中，阴阳性的界定不是依据空白组（细胞中不加 PI 也不加 Annexin V），而且依据阴性对照组（细胞不经过药物处理，但是加入 PI 和 Annexin V）。这是因为一般情况下，凋亡检测中，加入 PI 和 Annexin V 之后是不洗涤的，这意味着溶液有本底的荧光，阴性对照的信号肯定是比空白组要高的，如以空白组定阴阳性界限会出现大量假阳性细胞，而以阴性对照组来定阴阳性界限是更符合逻辑的方式。