血液中免疫细胞的流式分型

免疫系统是机体抵御外来入侵、清理自身异化细胞或组织的重要组成部分，关乎生物的健康与生存，一直以来是生物学和医学研究的重点和热点领域。在机体的生理和病理过程时，免疫细胞通过脉管系统和血液循环从淋巴器官抵达全身，对血液中免疫细胞的流式分析是生物学和医学研究中最常用的了解机体免疫状态的检查手段之一。血液中的细胞主要分为红细胞（Erythrocytes/Red Blood Cells）和白细胞（Leukocytes/White Blood Cells）。我们常常所说的免疫细胞指的是血液中的白细胞。机体中几乎所有的免疫应答过程，都是由各种不同的白细胞相互协作完成，因此它们也一直都是各种感染、炎症、自身免疫疾病、移植等模型研究的主要对象。

Figure1. 造血干细胞分化树

白细胞从起源上分为淋巴细胞和髓系细胞。血液中几乎所有细胞都有相同的来源——造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells，HSC）。造血干细胞在骨髓中分化为共同淋巴样祖细胞（Common Lymphoid Progenitors，CLP）和共同髓系祖细胞（Common Myeloid Progenitors，CMP）。

1. 淋巴细胞

CLP 主要分化得到不同的淋巴细胞群，包括 B 淋巴细胞（B Lymphocytes）、T 淋巴细胞（T Lymphocytes）和自然杀伤细胞（Natural Killer Cells）。从数量上来讲，B 细胞和T细胞数量占绝对优势，是获得性免疫的主要执行者。它们在骨髓（Bone Marrow）中形成，但是 T 细胞会转移到胸腺（Thymus）中发育成熟并最终进入的脾脏、淋巴结等外周淋巴器官，而 B 细胞在成熟之后直接进入外周淋巴器官，这也是这两群主要的淋巴细胞名称的由来。NK 细胞的数量相对于 B 细胞和T细胞来讲非常稀少，但是 NK 细胞具有非常强烈的细胞毒作用（Cytotoxicity），在机体的天然免疫中占据非常重要的地位。

T 细胞主要分泌一些免疫效应分子（如IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17、IL-21等）或者直接对感染或异化的免疫细胞进行杀伤，CD3 是 T 细胞的主要表面标志物；B 细胞是抗体的来源细胞，激活后大量产生抗体的 B 细胞特称为浆细胞，是机体生产抗体的工厂，其常用的表面标志物为 CD19。在流式检测中，我们通常用 CD3（人：Cat#E-AB-F1001；小鼠：Cat#E-AB-F1013）和 CD19（人：Cat#E-AB-F1004；小鼠：Cat#E-AB-F0986）的抗体对淋巴细胞进行标记和区分。其中，CD3+CD19-的细胞群为 T 细胞，而CD3-CD19+的细胞群通常被认为是 B 细胞。在 T 细胞中，我们通常还会再根据功能的不同，用CD4（人：Cat#E-AB-F1109；小鼠：Cat#E-AB-F1097）和CD8（人：Cat#E-AB-F1110；小鼠：Cat#E-AB-F1104）的抗体来标记T细胞，将 T 细胞区分为 CD4+CD8-的辅助性T细胞（T helper cells，TH）和 CD4-CD8+ 的杀伤性T细胞（Cytotoxic T Cells, CTL）。辅助性 T 细胞在免疫应答中，主要通过分泌细胞因子的方式，调控其它免疫细胞的活化；而杀伤性 T 细胞则可以通过细胞毒作用直接对感染或者转化的细胞进行杀伤。

NK 细胞又被称为大颗粒淋巴细胞，其细胞质中存在大量颗粒状的囊泡，储存颗粒酶 B（Granzyme B）等杀伤性免疫效应分子。NK 细胞的功能与 CTL 类似，主要是识别并杀伤异化或者被感染的自身细胞，但是与 CTL 不同，它可以识别 MHC I缺失的细胞，与 CTL 互补。人和小鼠的 NK 细胞表面标志物差异较大，在流式检测中所用的抗体也有所不同。人外周血NK细胞主要通过 CD16（Cat#E-AB-F1005）和CD56（Cat#E-AB-F1006）来确定，双阳的细胞被认为是 NK 细胞。在小鼠中，通用的表面标志物是CD49b（Cat#E-AB-F0988），而对于免疫学研究中最常用的 C57BL/6 小鼠，还有专门的 NK 表面标志物 NK1.1（CD161c， Cat#E-AB-F0987）。配合 T 细胞的表面标志物 CD3（Cat#E-AB-F1013），我们可以将 CD3- NK1.1+或者CD3- CD49b+细胞定义为 NK 细胞。

2. 髓系细胞

血液中的髓系细胞主要有单核/巨噬细胞（Monocytes/Macrophages）、树突状细胞（Dendritic Cells）和粒细胞（Granulocytes）等。其中单核细胞是未成熟的前体细胞，一旦从血液进入组织，单核细胞就会分化为巨噬细胞和树突状细胞，它们都是机体内专职的抗原递呈细胞（Antigen-presenting Cells, APC）。粒细胞主要分为三种：中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。其中，中性粒细胞在哺乳动物血液白细胞中所占比例最大，而嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞数量稀少，均不超过白细胞数量的 1%，在免疫学研究中的关注相对较少。

血液中的单核细胞对机体发生的损伤和炎症响应迅速，通常在 8~12 小时就能进入病灶部位。小鼠血液中，单核细胞以典型的 CD11b（Cat#E-AB-F1081）和 CD115（Cat#E-AB-F1107）双阳特征出现，而在人的外周血中，高表达 CD14（Cat#E-AB-F1084）和低表达 CD16（Cat#E-AB-F1005）被认为是单核细胞的特征。人的单核细胞分化成巨噬细胞时，CD14表达水平下降，CD16 表达水平升高，与单核细胞能明显区分；小鼠成熟的巨噬细胞则高表达 F4/80（Cat#E-AB-F0995），流式检测时用CD11b 和 F4/80 可以与其他单核细胞区分。巨噬细胞，正如它的名字所提示的，具有吞噬的功能，主要功能是清除被抗体识别的感染或异化的细胞和凋亡或坏死的细胞，是机体内的清道夫。巨噬细胞的消化能力较强，通常经巨噬细胞递呈的抗原多肽过短，导致巨噬细胞的抗原递呈能力有限。而树突状细胞具有适中的抗原消化能力，其表面高表达 MHC II（人HLA-DR：Cat#E-AB-F1111；小鼠 I-A/I-E：Cat#E-AB-F0990）以及丰富的共激信号分子（Co-stimulatory Molecules）。在捕获外来抗原的后，树突状细胞能将其水解为合适长度的多肽片段，并通过表面丰富的MHC II 递呈给辅助性 T 细胞，通过共激分子强烈激活 T 细胞，使其增殖、活化并分泌大量免疫效应分子，因而树突状细胞具有最强的抗原递呈能力。除了特异性高表达的 MHC II外，CD11c（人：Cat#E-AB-F1009；小鼠：Cat#E-AB-F0991）也是一个在树突状细胞表面特异性高表达的蛋白，常常被用来标记树突状细胞，即在流式检测中树突状细胞的典型特征为CD11chiMHC II+。

粒细胞中，中性粒细胞在感染和炎症中的广泛参与，使得它在免疫学研究中受到更多关注。中性粒细胞，也称小吞噬细胞，其形态学上的典型特征是细胞内丰富的颗粒性囊泡和与众不同的多叶核，在流式数据上表现为显著高于其它细胞群的侧向散射信号。中性粒细胞的颗粒中含髓过氧化物酶、溶菌酶、防御素、杀菌渗透增强蛋白等，使其具备非常强的杀伤能力，是机体抵御病菌入侵的第二道防线。在流式检测中，人的中性粒细胞可以用CD66特异性标记，而小鼠的中性粒细胞可以用Ly-6G（Cat#E-AB-F1108）特异性标记。