诺奖得主 Jennifer 最新研究：CRISPR/Cas12c 无需切割 DNA 就可实现基因沉默，抵御病毒入侵

导读

CRISPR/Cas 系统为细菌提供了适应性免疫，同时其准确识别和切割特定 DNA 和 RNA 序列的能力也为植物、动物和微生物基因组编辑提供了强大的工具。目前，基于 CRISPR-Cas9 基因编辑的多项临床实验也已启动并获得突破性结果，为许多遗传疾病的治疗开辟了新的途径。

德国马克斯·普朗克病原学研究所的 Emmanuelle Charpentier 以及美国加州大学伯克利分校的 Jennifer A. Doudna 也因为开发了这一最重要的基因组编辑方法而摘得 2020 年诺贝尔化学奖的桂冠。

近年来，CRISPR/Cas 相关的研究也取得巨大的进展，其中多项研究均发现了一个包含 RuvC 的 Cas 蛋白家族，被称为 Cas12，其变体表现出不同的生化和细胞活性。

其中，Cas12c 最初发现于肠道宏基因组的小 DNA 片段中，虽然与其他 DNA 切割 Cas12 酶存在共同的特征，但这种蛋白质的一些生化特性仍然是未知的：比如其 RNA 识别和加工的机制尚不清楚；此外，由于缺乏可检测到的 DNA 酶活性，Cas12c 是否或如何为细菌提供抗病毒保护仍然是有待回答的问题。

2022 年 6 月 2 日，诺奖得主 Jennifer A. Doudna 及其团队在 Molecular Cell 发表了题为 A naturally DNase-free CRISPR-Cas12c enzyme silences gene expression 的研究文章，发现 Cas12c 是一种 RNA 引导的 DNA 结合酶，它不切割靶 DNA，而是通过 crRNA 介导的相互作用与靶 DNA 结合，并可以通过识别噬菌体必需基因来保护细菌免受噬菌体的感染。

图片来源：Molecular Cell

主要研究内容

Cas12c 可处理 pre-crRNA，但不切割 DNA

为了确认 Cas12c 是否具有发挥免疫保护功能的一系列酶活性，他们首先重组了 Cas12c 并对其进行了更详细的探索。结果发现，不像其他 Cas 酶可以直接结合重复序列的近端或内部，Cas12c 切割蛋白结合重复序列下游 17 个核苷酸的 pre-crRNA。

接下来，他们借助多种底物检测了 Cas12c 切割 DNA/RNA 的能力，均发现 Cas12c 无法切割这些与导向 RNA 互补的底物。因此，这些结果表明 Cas12c 是 RNase（核糖核酸酶），而不是 DNase（脱氧核糖核酸酶），无法对 DNA 进行切割。

图片来源：Molecular Cell

Cas12c RuvC 结构域负责 pre-crRNA 的处理

随后，研究人员推测 Cas12c 的 RuvC 核酸酶结构域是执行 pre-crRNA 加工的部位。与该假说一致的是，当将 RuvC 金属配位羧酸盐突变后，Cas12c 的 pre-crRNA 处理活性随即丧失。

为了验证 RuvC 结构域在 pre-crRNA 加工中的作用，他们评估了 Cas12c 加工 pre-crRNA 后产生的 RNA 产物的性质，结果发现处理后的 RNA 切割片段的电泳迁移率降低，这与金属离子依赖的催化机制一致，表明 Cas12c 的金属离子依赖的 RuvC 结构域负责 pre-crRNA 的处理。不过，后续的更加深入的实验结果也表明 RuvC 结构域在 Cas12c 中的作用也仅为 pre-crRNA 的处理。

图片来源：Molecular Cell

RNA 引导的 Cas12c 与 DNA 结合依赖于 pre-crRNA 的加工

上述的实验已经证明 Cas12c 不进行靶 DNA 切割，那么 Cas12c 是否能结合经由 RNA 引导的互补底物？结合筛选实验表明，Cas12c 在低纳米摩尔范围内可结合目标 dsDNA，并对部分碱基配对的 DNA 具有更强的亲和力。因此，这些数据表明，像其他 Cas12 酶和 Cas9 一样，Cas12c 也与目标 ssDNA 具有较高的结合亲和力但不能检测到与 ssRNA 结合。

图片来源：Molecular Cell

Cas12c 的 pre-crRNA 加工活性提示 crRNA 成熟可能对目标 dsDNA 结合至关重要。为了证实这一想法，他们测试了在 pre-crRNA 或成熟 crRNA 的介导下，Cas12c 的 DNA 结合亲和力。

结果发现，野生型 Cas12c 在每种情况下都能以相似的亲和力与目标 dsDNA 结合；然而，当 pre-crRNA 含有阻止 Cas12c 催化过程的硫代盐时，Cas12c 对 dsDNA 的结合作用有明显的减弱。因此，这些结果表明，CRISPR-Cas12c 系统的功能需要 pre-crRNA 的处理，如果没有 pre-crRNA 的处理，Cas12c 则无法有效地结合目标 dsDNA。

Cas12c 可以在不触发 DNase 活性的情况下阻断基因表达

前期的研究发现，Cas12c 可以靶向细菌中生存必需的基因，这可能是由于体内 Cas12c 介导的基因组靶点的切割，也可能是 Cas12c 通过靶向聚合酶阻断反应来介导转录沉默。为了探索这些可能性，研究人员利用大肠杆菌开发了一种双色荧光干扰试验，其中编码红色荧光蛋白（RFP）或绿色荧光蛋白（GFP）的报告基因被整合到大肠杆菌基因组中。

Cas12c 定向切割导致的染色体断裂对大肠杆菌是有毒的；相比之下，如果 Cas12c 结合但不切断靶 DNA，则会观察到基因靶向荧光团的损失而不导致细胞死亡。他们的实验结果表明，野生型 Cas12c 和 RuvC 失活的 dCas12c 在靶向 GFP 或 RFP 的 sgRNA 的引导下，可以沉默基因表达而不杀死细胞。因此，这些结果也与上述生化数据一致，即 Cas12c 是结合但不切割目标 DNA。

图片来源：Molecular Cell

天然 Cas12c 保护细胞免受噬菌体感染

在自然界中，CRISPR-Cas 系统被认为是通过 RNA 引导外源核酸的切割来保护原核生物免受病毒感染，而 dsDNase 活性是所有已知的 DNA 靶向 CRISPR 系统的关键功能。然而，Cas12c 没有可检测到的 DNase 活性，那么其是否也能够仅基于靶向 DNA 结合提供抗噬菌体免疫保护作用？

他们使用噬菌体空斑实验来回答了这一问题。结果与预期一致，他们的确观察到了野生型 Cas12c 具有独立于 DNA 链靶向的抗噬菌体活性。

图片来源：Molecular Cell

此外，与靶向非必需基因相比，Cas12c 与靶向噬菌体必需基因的 sgRNAs 配对，可以使斑块减少几千倍。有趣的是，RuvC 失活的 dCas12c 的结果与野生型 Cas12c 的结果类似，这表明噬菌体防御是独立于 RuvC 活性发生的。

图片来源：Molecular Cell

结语

在微生物的进化中，CRISPR-Cas 酶通过降解外源核酸为微生物提供免疫，可以保护细菌免受病毒侵害。在这项研究中，Jennifer A. Doudna 团队揭示 CRISPR-Cas12c 的一个重组 RuvC 结构域只切割 precrRNA，而不是目标 DNA，在不对入侵者进行化学攻击的情况下完成抗病毒干扰。

此外，他们发现 Cas12c 的 RuvC 结构域只催化 pre-crRNA 的成熟，以介导 Cas12c 与靶向 DNA 结合进而发挥转录抑制的作用。同时，这种天然的不含 DNase 的 Cas12c 酶可以在针对噬菌体必需基因时保护细菌免受噬菌体感染。

总之，这些结果表明，即使在不具有 DNA 切割活性的情况下，CRISPR 系统也可以提供抗噬菌体免疫保护功能。

图片来源：Molecular Cell