基因编辑再次升级！领域大牛刘如谦 Cell 发文开发新工具，可安全高效进行体内基因编辑

刘如谦，著名的华裔科学家，美国博德（Broad）研究所核心研究员，张锋的校友。2017 年推出单碱基编辑（Base Editor, BE），2019 年又推出了先导编辑（Prime Editor, PE）。刘如谦带领团队开发的这一系列基因编辑工具能够在不造成 DNA 双链断裂的情况下，实现对基因组的点突变进行定点矫正修复，因此被认为是比较安全的，也更具有临床应用前景。前期的研究工作也已经证实可以应用 BEs 来纠正小鼠和非人灵长类动物的致病点突变并改正疾病表型，强调体内碱基编辑作为一种治疗策略的潜力。

要想将碱基编辑技术广泛应用于临床治疗，那么就需要安全有效的方法将单碱基编辑器输送到多个组织和器官。截至目前，最常用和最有效的载体仍然涉及病毒的使用，例如慢病毒和腺相关病毒等。然而，病毒作为载体会延长在转导细胞中的表达，这也就增加了脱靶的频率。

由于核糖核蛋白（RNPs）在细胞中的生命周期较短，因此直接传递 BE RNPs，而不是编码 BE 的 DNA 可以显著降低脱靶的频率。然而，在体内将 BE RNPs 传递到多个组织和器官的通用策略尚未被报道。

病毒样颗粒（VLPs）是一种可以感染细胞但不含病毒遗传物质的病毒蛋白质组合，已成为一种有潜力的载体，可以将基因编辑器 RNPs 传递给细胞。不过，到目前为止，现有的用于传递基因编辑器 RNPs 的 VLPs 策略的编辑效率比较一般，且体内治疗效果的验证有限。

2022 年 1 月 11 日，哈佛大学刘如谦团队在国际顶尖期刊 Cell 发表了题为 Engineered virus-like particles for efficient in vivo delivery of therapeutic proteins 的研究性文章，报道了一种他们以逆转录病毒为基础而开发的工程化类病毒颗粒（Engineered virus-like particles，eVLP），它能够克服蛋白复合物递送的多个瓶颈而实现体内高效递送。

实验结果表明，eVLPs 可实现向人类原代细胞和小鼠多种组织（肝脏、大脑、眼睛）中高效递送治疗性蛋白 RNP 复合物，并在小鼠体内疾病模型中取得了良好的治疗效果。在将脱靶效率和 DNA 整合风险降至最低的同时实现治疗性蛋白 RNPs 在体内的高效递送，具有巨大的应用前景。

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主要研究内容

基于逆转录病毒的高效 BE-VLPs

首先，他们试图研究逆转录病毒是否能够以一种保持碱基编辑器活性的方式支持有效的 BE-VLP 的形成。作为第一代 BE-VLP（v1 BE-VLPs）的设计，他们融合了高度活跃的单碱基编辑工具 ABE8e，通过连接肽连接到逆转录病毒 FMLV 的 gag 多聚蛋白的 C 端，该连接肽在病毒颗粒成熟时被 FMLV 蛋白酶切割，从而释放 ABE8e 蛋白 RNP 复合物。

实验结果表明，v1 BE-VLPs 在 HEK293T 细胞的基因组位点实现高效递送和精准编辑，最高编辑效率大于 97%。这些观察结果表明，逆转录病毒 FMLV 支持了 BE-VLPs 的形成，v1 BE-VLPs 可以在体外有效地转导和编辑 HEK293T 细胞。

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VLP 的持续改善以优化其递送性能

虽然上述实验证明了 v1 BE-VLPs 可以在体外细胞系中实现高效递送和精准编辑，但这些常用的测试细胞系尤其容易被基因编辑，并且缺乏治疗相关性。考虑到只有在病毒颗粒成熟后才会发挥切割功能并释放出 ABE8e-RNP。所以他们认为切割效率可能会成为 BE-VLP 编辑的瓶颈。

在第二代工程编辑的 BE-eVLPs（v2 BE-eVLPs）中，他们对连接肽体系进行了优化。研究人员筛选了 4 个已知被 MMLV 蛋白酶以不同效率切割的不同连接子序列，并识别出几个新的 gag-ABE8e 连接子。发现与 v1 BE-eVLPs 相比，它们均提高了编辑效率。其中，v2.4 BE-eVLPs 在所有剂量下的编辑效率都比其他高 1.2 到 1.5 倍。因此，提高优化连接肽裂解动力学，可以提高 eVLP 的活性。

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随后，在 v2.4 BE-eVLPs 的基础上，通过添加出核信号（Nuclear Export Signals, NESs）增强了其入核能力和碱基编辑效率，并提高了逆转录病毒颗粒的包装效果，最终经过筛选获得 v3.4 BE-eVLPs 系统。

最后，研究人员发现，不同包装质粒间的化学计量比也会影响 BE-eVLP 系统的编辑效果。为了调节这种化学计量学，他们改变了 gag-3xNES-ABE8e 与转染 VLP 的野生型 MMLV gag-pro-pol 质粒的比例。结果发现 gag-pro-pol 质粒与 gag-3XNES-ABE8e 质粒的摩尔比例为 1:3 时获得最佳的碱基编辑效率，并命名为第四代 BE-eVLPs 系统（v4 BE-eVLPs）。

随后的实验也证明，v4 BE-eVLPs 支持有效、高效的基因编辑，并且显示出最小的脱靶编辑效率和 DNA 整合风险。

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v4 BE-eVLPs 有效地编辑人类原代细胞和小鼠细胞

为了进一步探索 v4 BE-eVLPs 的效用，他们评估了其在体外靶向和编辑多种原代人类或小鼠细胞的能力。在转导含有纯合子 COL7A1（R185X）突变的原代人类成纤维细胞中，他们观察到高于 95% 的修复效率。这种高效率在小鼠模型的原代成纤维细胞中也得到了重现。

这些结果验证了 v4 BE-eVLPs 的活性并不局限于细胞系，而且其在人类和小鼠成纤维细胞中都可以达到接近 100% 的碱基编辑水平。

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v4 BE-eVLPs 在体内中枢神经系统的碱基编辑

v4 BE-eVLPs 的体外活性表明，它们可能是体内传递 BE RNPs 的潜在应用载体。为了评估它们的体内传递效果，他们首先研究了 v4 BE-eVLPs 在小鼠中枢神经系统内实现碱基编辑的能力。他们将 v4 BE-eVLPs 系统注射到小鼠的脑室，发现在小鼠中枢神经系统中能实现目标位点高达 50% 的高效精准编辑。

因此，这些数据建立了 v4 BE-eVLPs 作为中枢神经系统碱基编辑应用的一种新的非病毒传递系统，该系统可提供高水平的活跃 BE RNPs，尽管未来仍然需要提高转导效率来实现大脑组织中高效率的编辑。

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v4 BE-eVLPs 恢复了遗传性失明小鼠模型的视觉功能

最后，他们应用 v4 BE-eVLPs 来纠正遗传性视网膜疾病成年小鼠模型中的致病点突变。研究人员将 ABE8e-NG-eVLPs 注射到 4 周大的由基因突变导致失明的 rd12 小鼠的视网膜下。注射 5 周后，获取视网膜色素上皮细胞并进行基因组高通量测序。

令人兴奋的是，测序分析数据表明其能够有效修复小鼠模型中的致病点突变，校正突变的效率为 21%，同时还观察到小鼠的视力部分得到恢复。这些结果表明 v4 BE-eVLPs 能够有效地纠正小鼠模型中的致病突变位点。

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结语

综上所述，该研究团队以逆转录病毒为基础，通过确定、设计和不断完善方案，解决了影响 VLPs 传递效率的三个不同瓶颈，开发了一种高效的、安全的、工程化的 VLPs 系统，将 v4 eVLPs 内的蛋白装载量平均提高了 16 倍，碱基编辑效率平均提高了 8 倍。同时，他们的研究结果还表明 v4 eVLPs 具有高度的通用性，适用于多种体外和体内编辑应用，并达到安全、高效的基因编辑效果。

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