8 色多重荧光免疫组化方法揭示补体在早期类风湿关节炎发展中的作用

图 2. 相关性/气泡图显示治疗后 48 种补体和 FcgR 基因的滑膜和血液基因表达，以及通过 DAS28-ESR 测量的基线和 6 个月时疾病活动度变化的相关性。

使用早期 RA 活检样本进行组织病理学和免疫组织化学研究以优化补体蛋白的检测。通过H&E和免疫组化IHC, 确认滑膜活检中存在七种补体蛋白和复合物，即 C3c、CFHR4、CFB、CFH、FCN3、MBL2 和 C5b-9 (MAC), 证实在 mRNA 分析中鉴定的个体补体蛋白确实在早期 RA 患者的滑膜中表达，因此可能在关节局部在关节炎和组织损伤的发展中发挥作用。图 3. 七 种补体蛋白的早期 RA 滑膜活检样本的H&E、免疫组织化学 (IHC) 染色结果，黑色箭头表示每种补体蛋白的阳性棕色染色。

图 4. 早期 RA 患者滑膜活检样本中补体蛋白阳性细胞定量分析

为了进一步证实补体基因及其各自蛋白质表达之间的相互关系，对早期 RA 患者滑膜活检样本中的 C3c、CFHR4、CFB、CFH、FCN3、MBL2 和 C5b-9 (MAC)，七种补体蛋白进行多重荧光免疫组化染色（mIHC），并对这些蛋白的整体分布及相互关系进行了分析。每种蛋白表达量进行定量分析。滑膜中的大量细胞分别是 CFH1，其次是 C3c1/CFB-/CFH- 和 C3c1/CFB-/CFH1。这种重叠的补体蛋白表达分析表明滑膜细胞在直接参与调节 AP 的早期 RA 活检中也表达了一种以上的补体蛋白。

图 5. 早期 RA 患者滑膜活检样本中7种补体蛋白的 8 色多重免疫荧光染色及其单个补体IHC染色结果图像。C3c-红色，CFB-粉红色，CFH-青色， CFHR4-洋红色，MBL2-绿色，FCN3-白色，C5b-9 (MAC)-黄色，DAPI-蓝色。 (A) 显著表达C3c 的样本 (B)同时检测到7种补体的样本。

多重免疫荧光图像显示，活检亚结构域中存在的另一个特征是 C3c 相对于 CFH 蛋白缺乏一致的表达。在一些活检中，CFH 明显存在于滑膜中，完全没有 C3c。相比之下，在早期 RA 滑膜的其他区域，CFH 和 C3c 完全分离，反映了局部激活与调节的潜在不平衡。值得注意的是，脂肪细胞之间的间隙中有更多的 C3c 沉积，而在血管周围有更多的 CFH 沉积。分别在滑膜下衬里区域和深滑膜下衬里区域观察到 CFH 和 CFB 的明显划分以及 C3c 共定位。图 6. 具有代表性的多重免疫荧光结果显示早期 RA 活检中滑膜和滑膜下区域存在免疫细胞和补体蛋白的区域失衡。CFH-青色、C3c-红色、CFHR4-紫色、CFB-粉色、FCN3-白色、C5b-9(MAC)-黄色。

分别量化了滑膜和滑膜下衬里区域中补体蛋白的存在。与滑膜衬里相比，滑膜下衬里区域的 FCN3、MBL2 和 MAC 呈增加趋势，但并不显著。总之，维持激活（即 C3c 和 CFB）和调节（即 CFH）之间的一般关系，促进对 CS 的整体控制。然而，如图 7 所示，这些区域中有许多单独的区域表现出显著差异，这表明存在依赖于上下文的激活位点。这种非常局部的激活和调节蛋白失衡表明，失调可能在滑膜组织内某些区域对补体激活刺激的反应和效应分子的产生中发挥特别重要的作用。图 7. 使用多色免疫荧光结果，对早期 RA 活检的滑膜和滑膜下衬里区域进行定量补体蛋白分析。