做了这么多的 WB，你知道化学发光和荧光可以一起检测吗？

一台 WB 成像系统可以同时拍摄化学发光和荧光信号，这个功能有什么用途呢？一篇 2014 年发表在 Cell Stem Cell 的文章为了研究硫巯基化如何影响信号通路，就需要在进行 Western Blot 时同时捕捉2种信号。

蛋白质硫巯基化（S-sulfhydration, SHY）是一种依赖H2S的蛋白质翻译后修饰。H2S 作用于蛋白质的半胱氨酸残基，把巯基（-SH）转变为硫巯基（-SSH），改变蛋白空间结构，调控了蛋白的活性和功能。

这篇文章主要研究硫化氢（H2S）调节 Ca2+ 通道硫巯基化，来维持间充质干细胞的功能和骨稳态。骨髓间充质干细胞产生H2S协助调节自我更新和成骨分化。H2S 缺乏会导致 Ca2+TRP 通道上多个半光氨酸残基的硫巯基化程度降低，产生钙内流异常。异常的钙内流会下调 PKC/Erk- 介导的 Wnt/β-catenin 信号，从而影响到成骨分化。结果提示通过无毒供体恢复 H2S 水平，可以治疗 H2S 缺乏导致的骨质疏松症等疾病。

有趣的事情来了。在验证 H2S 通过 Ca2+ 通道的巯基化调节钙内流时，研究人员将 BMMSCs 分成了 2 组，一组使用 NaHS 处理，一组则不作处理；然后用荧光马来酰亚胺染料 Alexa Fluor 488 C5 maleimide（下文简称MAL，Invitrogen，A10254）标记半胱氨酸上的硫醇基团，使正常的半胱氨酸通过 -S- 与 MAL 连接，而硫巯基化的半胱氨酸通过二硫键 -S-S- 与 MAL 连接，如下图：

图 1. 文献 Fig. 6G，硫巯基化分析步骤

接下来加入 DTT，硫巯基化蛋白上特有的二硫键就会被解开，导致荧光 MAL 分子脱落，荧光信号减弱。所以，荧光信号发生变化就验证了 BMMSCs 中确实发生了硫巯基化。

为了定量描述硫巯基化程度，作者还同时使用化学发光法进行了 western blot，检测出靶蛋白的总量作为 Input，对数据进行归一化（normalization）处理，结果如下：

图 2. 用马来酰亚胺分析 BMMSCs 中 TRPV3 和 TRPM4 钙通道的巯基化作用。NaHS- 和 DTT 处理的 BMMSCs 中，TRPV3 蛋白的绿色荧光降低。

实验原理巧妙，但操作步骤只需要在传统的 IP-WB 基础上稍作调整：

1. 荧光标记：AF488-C5-maleimide 染料与膜蛋白冰上孵育
2. preclear：加入 control IgG 和 protein A/G beads，孵育，离心，吸取上清
3. IP：先后加入抗体和 protein A/G beads 孵育，离心，保留 beads
4. RIPA 清洗 beads，DTT 处理
5. 煮样，蛋白电泳，转印
6. 采集荧光信号——激光扫描
7. 封闭，一抗孵育，HRP 二抗孵育
8. 采集化学发光信号——胶片显影

小编：如果那个时候有 iBright，就可以同时进行成像了。条带获取更容易，且对比数据更具代表性。

除了同时检测化学发光和荧光目的条带。这个功能有什么更普遍的应用呢？

有，那就是进行总蛋白归一化（Total Protein Normalization, TPN）。在一张膜上，用荧光检测总蛋白，用化学发光检测目标蛋白条带，使用 iBright 成像系统拍摄的图片如下。同一张膜上进行操作，信号互不干扰，结果又快操作又方便。

图3. 用各种试剂处理 HCT116 细胞：HCT116 血清饥饿 24 小时，并用 LY294002（50μM，1小时）、雷帕霉素（10nM，1小时）和/或 BEZ235 （500nM，1小时）预处理。预处理后，在每个样品（12.8nM，15min）中加入胰岛素样生长因子-1（hIGF-1）。细胞裂解，用 WB 测定 p-AKT（Ser473）的相对含量，用 No-Stain 蛋白标记试剂进行总蛋白归一化检测。

参考文献：Yi Liu,. Hydrogen Sulfide Maintains Mesenchymal Stem Cell Function and Bone Homeostasis via Regulation of Ca2+ Channel Sulfhydration. April,2014. Cell Stem Cell
http://dx.doi.org/10.1016/j.stem.2014.03.005

文章来源：赛默飞世尔科技