流式结果容易出现「假阳性」怎么办？多年经验总结来啦

问题一：为什么要做补偿调节

流式细胞术是通过检测不同荧光染料发射光谱来判断细胞是否发生凋亡。

由于光的发射波长不是一个具体值而是一个范围，所以会存在发射光谱「重叠」的现象，此时单个通道内可能检测出多个荧光基团的荧光从而造成「假阳性」现象，因此必须通过补偿进行修正，以确保所检测的荧光来自单一的荧光染料。

如下图所示，浅绿色和浅黄色部分分别代表 FITC 和 PE 发射波长范围，深绿色和深黄色为 FITC 和 PE 通道滤光片吸收的部分，其中浅黄色和浅绿色之间有一部分是重叠的，所以 FITC 染料发射出的光可以被 PE 光路通道吸收到（也就是红色框的部分），导致出现假阳性的结果。因此需要补偿调节，把 PE 通路吸收到的光消掉，去掉假阳性结果。

（图片来自于 abcam 公司）

问题二：如何进行调节补偿

流式细胞仪的荧光补偿设置过程大致相同，需要根据仪器说明书在检测过程中进行设置，也可以下机后利用 FlowJo 等软件进行补偿。下面以 12 μM 的喜树碱处理 293 悬浮细胞 4 h 的结果为例演示如何用 FlowJo（版本号：v10.6.2）进行补偿调节，此处分别介绍自动补偿和手动补偿。

1. 选中需要分析的样本，直接将其拖进软件中，四个文件分别是 KB（空白组）、PE（PE 单染管）、AAD（7-AAD 单染管）、PE + AAD（实验组）。

2. 双击「空白组」，可以看到采集的最原始的数据，圈出需要分析的细胞群。注意不要圈到细胞碎片，圈细胞群可以选择椭圆形、方形和任意图形等，可以根据自己习惯进行选择。

3. 双击圈出的细胞群，结果如下面右图所示，需要选择坐标，该坐标的选择与通道有关系，我用的是 7-AAD 和 PE，对应的分别是 PerCP 通道和 PE 通道。横纵坐标也可以调节，通过坐标调节确保所有样本都在可视范围内。

4. 确定好坐标和位置之后，将该分析应用到所有组。

1. 观察两个单染管，发现 PE 单染管出现假阳性，需要补偿，下面进行自动补偿。

2. 选择空白管和两个单染管，拖进「Compensation」，然后点击类似于小山的图标。

3. 仪器默认会出现很多通道，可以删除自己不需要的。例如本次分析中只需要 7-AAD 和 PE，其余可以删除。Sample 中选择对应的样本，例如 PE-A 中在 Sample 需要选择 PE 单染管，同理 PerCP-A 需要选择 7-AAD 单染管，在 Negative 下面都选择空白组，详见下面第二张图（红色框框里的内容），然后点击「Apply To Group」。

Tips：删除不需要的组时，点击不需要组所对应的 Sample，右击，选择「remove this parameter」

4. 再看两个单染管，已经自动进行了补偿。注意一定要将横纵坐标换成「comp」开头的。

1. 如果发现自动补偿不满足自己的需求，可以手动进行补偿。双击文件前面的九宫格，可以得到该组的补偿数据，黄色部分代表现在的补偿数据，可以作为手动补偿的参考值。

2. 点击「Edit」，通过改变黄色位置的数字来进行补偿，该处数字没有具体值，需要一点点自己摸索。此时样本前面的九宫格也变会变换颜色，此处变成了橙色，也就是说黄色框内的补偿数值应用到了所有组。

问题三、补偿调节到什么程度比较合适？

我们需要明白为什么要做补偿？目的是为了减少假阳性。因此，一般需要调节单染管补偿至阳性细胞群和阴性细胞群中心在同一水平线上。如下图所示，此时是比较好的补偿数值，将数值应用到实验组就可以完成补偿，得到最后的结果，也就是咱们在文献中常见到的图！

（图片来自于 abcam 公司）

好了，补偿调节就完成了，你学会了吗？