miRNA的靶基因的寻找与鉴定

一、miRNA的靶基因寻找
研究表明，一个基因可以受多个miRNA调控，而一种miRNA又可以参与调控多个靶基因，据预测，至少有30%的人类基因是miRNA的靶基因。这就足以显示出miRNA群体的重要性。而在人类疾病中多不同程度的表现出大量miRNA的上调和下调，这也足以显示miRNA在疾病发生过程中占据着非常重要的作用。而探讨miRNA的功能作用中最重要的一步就是高效准确的寻找到其所调控的靶基因。目前寻找靶基因主要是从以下两个方面入手。
1．生物信息学方法
miRNA靶基因的预测主要是根据生物信息学的方式进行，主要是根据以下几个方面进行预测：①miRNA与靶基因结合位点的互补性；②miRNA靶位点在不同物种之间的保守性；③miRNA-mRNA结合的热稳定性；④miRNA靶位点处不应有复杂二级结构；⑤miRNA5′端与靶基因的结合能力强于3′端。除以上几个基本原则外，不同的预测方法还会根据各自总结的规律对算法进行不同的限制与优化。目前比较常用的靶基因预测软件有：miRanda、TargetScan、PicTar、miRWalk、miRanda、miRDB等，其中在miRWalk中可以查找到已经被研究证实的miRNA的靶基因，也可以查找与某种疾病相关的miRNA等。
虽然靶基因预测软件很多，但其预测特异性和敏感度还有待改善，一个软件针对一个miRNA通常可以预测出上千条靶基因，这就为后续的实验验证带来了许多困难，虽然我们可以结合多个软件进行miRNA的靶基因预测，但在取几个软件预测结果的交集时也忽略了许多真实的靶基因，在这两者之间的权衡就需要我们研究者去综合参考其他方面的因素来抉择。比如，我们可以结合DAVID软件对所选靶基因进行GO分析或通路分析，来针对某一特定功能方面进行靶基因的选择。
二、 miRNA靶基因的验证
与miRNA靶基因 的预测方法相比，对miRNA靶基因进行实验验证的方法并不多，目前还没有一个快速、简便、高通量的鉴定方法。最直接的鉴定方法是， 利用荧光定量PCR及Westernblot方法分别检测转染或敲低miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变化，从而确定miRNA与靶基因的对应关系。这种方法能够直接鉴定出miRNA的靶基因， 准确度高但不能鉴定miRNA的靶位点。
转染或敲低miRNA：方式主要有两种，一种是构建miRNA过表达载体的稳定表达系统，一种是人工合成miRNA类似物的瞬时表达方式。miRNA的过表达载体中有插入成熟miRNA、pre-miRNA及pri-miRNA序列三种形式。其中pri-miRNA（含侧翼序列）的方式由于保留了每个microRNA独自的原始天然双臂结构，效果更好，是应用最为广泛的方法。microRNA过表达系统中有CMV启动子（II型启动子）和H1启动子（III型启动子）两种方式供选择。
III型启动子（H1、U6等）具有表达效率高、有效的确定终止位置等优点，成为首选。II型启动子适用于pri-miRNA序列中有连续的5个T-导致III型启动子（CMV、Ubi等）终止转录的情况。载体系统也分多种，包括慢病毒载体、腺病毒载体、质粒载体等。瞬时过表达方式主要是经过人工化学修饰的运用化学方法合成的双链RNA，能模拟细胞中内源性成熟miRNA的高水平表达，以增强内源性miRNA的调控作用，进行功能获得性研究。只需直接转染进入细胞，即可检测功能变化，快速，方便。
miRNA靶位点鉴定：目前最为常用的miRNA靶位点鉴定方法是荧光素酶报告基因法。其基本原理是首先构建荧光素酶表达载体，将希望鉴定的miRNA靶基因的3′UTR构建到荧光素酶基因的3′UTR中，之后将构建好的载体转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平，最后检测荧光素酶的表达情况以分析转染3′UTR中是否含有miRNA的靶位点。
近几年来，对miRNA的研究已经成为医学科研领域中的一个重要方向。越来越多的研究揭示出其在疾病的发生及发展中处于重要地位，另外，它在疾病诊断、治疗及预后提示方面的作用也被有关研究所证实。在目前很多课题研究都会涉及miRNA领域，而了解miRNA基本研究思路及方法是研究中不可缺少的一步。在设计课题方案时，我们要灵活选择运用这些研究方法，以便使我们的研究方案更加新颖、合理、严谨。