PCR引物设计后验证的实用工具

我们在设计pcr引物的时候，经常需要将设计好的正反向引物与基因组DNA序列进行比对验证，但是因为反向引物是反向互补的，所以有些麻烦。因此，在这里介绍两个非常的小工具，一个是在线的模拟PCR，一个是本地运行的程序包，我会以附件形式上传，不需要丁当即可下载。两个都写得非常详细，相信大家都能看懂。不知道这个帖子能不能加分？希望版主看到后给予加分奖励

方法一：UCSC中的In-Silico PCR

1、登录UCSC，网址链接http://www.genome.ucsc.edu/index.html，点击右侧工具的In-Silico PCR，或者在Tools下拉框中点击In-Silico PCR，如下所示：

2、点击In-Silico PCR后，出现如下界面，我们需要将自己设计好的正向引物和反向引物分别粘贴至各自空白框，点击submit。对其它几个参数做点说明吧，Max Product Size是指被放大区域的最大长度，Min Perfect Match是指和引物的3‘末端Perfect Match的最小碱基数目，Min Good Match: 是指和引物的3‘末端Good Match的最小碱基数目，Good Match是3个碱基里最少匹配2个，Flip Reverse Primer: 反向引物反向互补。

3、我用自己设计的基因举例说明： HNF-1α 的 EXON2，参考序列：NM_000545，正向引物5’-3‘：CAGCCCTTGCTGAGCAGATCC， 反向引物5’-3‘：CCACTGACTTCCTTTCCATCTACC 。 正向引物和反向引物分别粘贴至各自空白框，点击submit。出现如下结果，其中第一个红色标记指染色体位置，第二个红色标记指长度，第三个红色标记是我们输入的正反向引物，第四个标记可以直接链接至Primer 3在线设计引物，网址http://primer3.ut.ee/。比对染色体位置就可以知道我们设计的引物是否包括HNF-1α 的 EXON2。

方法二：Reverse程序

这个程序是一位程序员朋友专门为我们编写的，操作非常简单，输入反向互补的引物序列后，就可以得到原始碱基序列。文件夹内一共才3个文件。

举例说明，HNF-1α 的 EXON2，参考序列：NM_000545，正向引物5’-3‘：CAGCCCTTGCTGAGCAGATCC， 反向引物5’-3‘：CCACTGACTTCCTTTCCATCTACC 。

1、点击target，粘贴反向引物序列。

2、点击右上角关闭键，这时候会弹出对话框，点击保存。

3、打开文件夹中的reverse_complement应用程度，按任意键即可自动关闭。

4、打开文件夹中的result，就可以得到反向互补引物序列对应的原始序列。

5、这时候就可以将正向序列和刚刚得到的原始序列一起代入HNF-1α 的 EXON2中检验我们设计的引物是否覆盖了目标片段。