差异凝胶电泳

将样品在电泳前标记Cy2、Cy3 和Cy5 这3 种荧光染料,然后将标记后的3 种样品混合, 同时在一块胶上进行电泳,即为差异凝胶电泳(DIGE) 。所得到的2D 胶图像可使用3 种不同的激发P发射过滤器得到不同颜色荧光信号,根据这些信号的比例来判断样品之间蛋白质的差异,这样可避免在匹配时出现的误差,进行定量分析时也不依赖于胶与胶之间的重复性。用于标记的荧光基团在化学结构上相似,分子量也基本相同,都带有正电荷,所以在与赖氨酸残基反应时,保证了所有的样品可以移至相同的位置。该方法的灵敏度可与银染和SYPRO Ruby 相媲美, 可检测到100～200pg 的蛋白质,线形动态范围在5 倍左右。已有很多文献证明该方法的灵敏性和重复性,如用该方法研究苯甲酸对大肠杆菌的抑制作用和食道癌的特征蛋白。该方法也提高了定量上的准确性。由于实验方法本身造成的蛋白质斑点强度的差异,比如样品在进入胶条时会有一些样品损失,但在同一块差异凝胶电泳胶上就不会出现这样的差异。目前出现了一种改良了的DIGE 技术使其更好的进行定量分析, 该技术将Cy2 作为用Cy3、Cy5 标记的蛋白质内标, 用以比较数据库中各个胶之间的蛋白质的量的差异。DIGE 可在同一次检测中通过分析单一胶上的相互覆盖的信息来得到蛋白质的信息,可以同时在一块胶上在相同电泳条件下分离2～3 个样品,大大减少了一个实验需要的胶的总数 。
虽然从理论上来说,该方法非常诱人, 但DIGE 本身还有很多技术上的问题。如:1) 只有当约1 %～2 %的蛋白质的赖氨酸残基在荧光标记时修饰,才可以维持被标记的蛋白在电泳时的溶解性;2) 在DIGE 染色中丢失的蛋白质基本确定为样品中的低丰度蛋白; 3) 虽然经染色后在电荷上未发生变化,被染料标记的蛋白质比未标记的蛋白质点向大分子方向有轻微迁移,主要是由于荧光团的加入。这使得在标记的和未标记蛋白之间产生95 %的误差, 之后在质谱分析时产生更多的复杂问题。可通过再染色的方法以使割点的步骤不出错。但考马斯亮蓝染色比DIGE 染色方法灵敏度低,有约40 %的兴趣蛋白质点不能从考马斯亮蓝染色的胶上被发现。因此,高灵敏度的染色方法SYPRO Ruby 被用于作为DIGE 后染色的方法。4) 另一个值得注意的影响灵敏度的问题是荧光物质在激发P发射过程中会出现信号的相互干扰。引发Cy3 的激发波长有时可引起Cy5 标记的蛋白发射。