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功能基因组学研究新方法——双色红外荧光检测技术

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基因组序列的迅速获得推动了一门新兴学科——功能基因组学的发展,这一学科重点关注基因功能的变化。扩增性片段长度多态性(Amplified restriction fragment length polymorphism,AFLP)分析以及反向遗传学都是功能基因组学的重要组成部分。
  传统的反向遗传学,例如用转座子(transposon)敲除特定基因,虽然可以准确测定表型,但需要进行耗时的转基因或复杂的组织培养。而且由于这种基因敲除的方法将整个基因敲除,无法观察到活性基因功能部分缺失的结果。
  为克服此基因敲除方法的局限性,进一步获得关于活性基因突变的信息,Fred Hutchinson癌症研究中心的研究者们发明了一种定向诱导基因组局部突变(TILLING: Targeting Induced Local Lesions In Genomes)技术。该方法具有简单高效的特点,它利用化学突变方法来获得所有基因的传统的点突变等位基因系列。对那些表型分析时会牵涉到亚致死等位基因的重要基因,TILLING的方法具有其独特的优势。随着TILLING方法有效应用到越来越多的生物种类,如果蝇,拟南芥,斑马鱼,玉米等,它在遗传学研究方面的重要价值也越发体现出来。
  但由于点突变一般很难被检测出来,一直是TILLING技术应用上的一个障碍。要得到好的结果,要求检测仪器不仅灵敏度高,还能够识别假阳性位点。我们在这儿给大家引荐一种更简便,灵敏,准确的高通量TILLING分析技术:双色红外荧光检测技术。
  双色红外荧光检测技术是美国LI-COR公司的专利技术。LI-COR长期致力于此项技术在生物学研究中的应用,他们开发的Odyssey双色荧光扫描系统及DNA遗传分析系统都取得了很大成功。由于杂质、干扰分子在红外区几乎不发光,用红外荧光进行检测的背景非常低,灵敏度很高,可检测到低达15amoles的荧光分子。加上双通道检测(680nm激发,710nm检测;780nm激发,820nm检测),两个通道检测波长相距110nm,相对于通常的可见荧光四色检测来说,几乎没有光谱重叠的干扰(见下图),保证了TILLING分析中每一个突变碱基的准确识别及整个检测的灵敏度。
  以下就具体给大家介绍双色红外荧光检测技术在反向遗传学中与TILLING法结合的应用,及基于双色红外荧光检测技术的LI-COR 4300 DNA分析系统与之相应的技术优势。

红外荧光检测技术在反向遗传学中的应用
  将红外检测技术同TILLING技术结合,其优势已经被全世界许多实验室证实。美国国家科学基金会植物基因组计划(NSF Plant Genome Research Program (PGRP))近年来大力发展高通量TILLING,并直接推动了以美国为首的北美实验室联合启动拟南芥 TILLING项目(ATP:Arabidopsis TILLING Project)。该项目组使用 LI-COR DNA 分析系统在其成立的第一年就为拟南芥研究者们提供了100多个基因上的1000多个突变位点。本文就以此为例来介绍红外荧光检测技术在反向遗传学中的应用。
1 对拟南芥种子进行诱导处理产生一系列点突变
2 将种子培养,获得第一代拟南芥突变个体
3 第一代植株自花授粉,产生第二代
4 将第二代植株种子收集,抽提DNA,存放于96孔板
5 将多个96孔板的样本合并到1个96孔板内(最多可合并8个),用两对特异性引物进行PCR扩增,两对引物分别用700nm和800nm荧光染料标记。
6 对拟南芥种子进行诱导处理产生一系列点突变
7 将种子培养,获得第一代拟南芥突变个体
8 将第二代植株种子收集,抽提DNA,存放于96孔板
9 分别得到700nm和800nm两张图。发生突变的泳道,在700nm的图上可以在野生型条带下方看到一个条带,同时在800nm的图上相同的泳道也会有一个条带,这两个条带就是CEL I核酸酶的剪切产物,两个条带片断大小之和等于扩增片段的大小,从而很容易对扩增产物进行突变检测
10 当混合样本检测到突变后,要对混合样本中的每个DNA样本再次进行筛选,检测出发生突变的DNA样本。

TILLING技术路线
技术关键一:获得高质量的TILLING图像

  将红外荧光检测技术与TILLING技术结合后,可以同时获得两张真实的电泳图像(700nm和800nm)。应用TILLING技术时,获得未经修改的图像原始数据对于检测的灵敏度和准确性都很重要。如果检测系统在检测时对荧光数据已经进行了处理,很可能会过滤掉大部分甚至是全部的突变信息。
技术关键二:双色成像能有效排除假阳性突变
  通过PCR反应得到的异源核酸双链分子在碱基错配处被切断。由于两个剪切片断采用不同的荧光染料标记,如果真的发生了突变,双色检测时将在野生型条带下面出现两个突变条带,分别位于700nm和800nm电泳图的同一泳道。同时,这两个突变条带的分子量之和应该等于野生型条带的分子量,因而双色检测能够有效排除假阳性点突变,准确度很高。
技术关键之三:高灵敏度的红外检测
  由于核酸外切酶活性会导致一些信号丢失,应用红外检测技术提高灵敏度对于TILLING检测非常重要。红外荧光检测相对可见光检测具有背景低、灵敏度高的优点。此外,结合红外荧光染料后,该检测方法还具有另一个优点——宽广的线性范围。这一特点使得强信号和弱信号能够同时被分辨,当野生型条带的信号强,突变型条带信号弱时,LI-COR DNA分析系统也能够轻松识别突变。

高通量的突变筛选
  结合4300分析系统,TILLING作为一种高通量的筛选技术,其通量可达到:
每块胶可检测750,000碱基对
每天可检测2000样本
每天可检测2百万碱基对
每个样本可检测1000个碱基


应用Tilling 技术发表的一些文献:
1. Till, B.J., Reynolds, S.H., Greene, E.A., Codomo, C.A., Enns, L.C., Johnson, J.E., Burtner, C., Odden, A.R., Young K., Taylor, N.E., Henikoff, J.G., Comai, L., and Henikoff, S. 2003. Large-Scale Discovery of Induced Point Mutations With High-Throughtput TILLING. Genome Research 13:524-530.
2. Henikoff, S., and Comai, L. 2003. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54:15.1-15.27.
3. Colbert, T., Till, B.J., Tompa, R., Reynolds, S., Steine, M.N., Yeung, A.T., McCallum, C.M., Greene, Comai, L., and Henikoff, S. 2001. High Throughtput Screening for Induced Point Mutations. Plant Physiology 126: 480-484.
4. McCallum, C.M., Comai, L., Greene, E.A., and Henikoff, S. 2000. Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) for Plant Functional Genomics. Plant Physiology 123:439–442.

红外荧光检测技术在AFLP研究中的应用
  除了以上提到的反向遗传学中的应用外,红外荧光检测技术在AFLP研究中的应用也日益广泛。该领域的许多文章都使用LI-COR DNA 分析系统完成。LI-COR公司针对 AFLP研究提供包括试剂、仪器、分析软件在内的全套AFLP分析解决方案,不仅能进行传统的基因组AFLP分析,还提供专门的试剂盒进行表达性的cDNA AFLP分析,如果结合LI-COR的Odyssey红外荧光扫描成像系统,还可将AFLP电泳条带回收进行进一步的研究,为研究者提供了极大的便利。分析软件方面,LI-COR公司秉承了其“功能细致强大,自动化程度高”的一贯优点,仅针对AFLP一项就有Gene ImagIRTM, SAGAMX, AFLP QuantarTM Pro三种不同的软件,分别满足一般性用户、专业用户和特殊的共显性分析的需要,彻底解决了数据分析的瓶颈制约。

AFLP相关文献:
1. Identification on Commercialized Products of AFLP Markers Able To Discriminate Slow- from Fast-Growing Chicken Strains。OLIVIER FUMIEÅ RE~undefined,† MARC DUBOIS,† DIMITRIE GREÄ GOIRE,† ANDREÄ THEÄ WIS,‡ ANDGILBERT BERBEN†J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 1115-1119
2. High-Throughput AFLP® Analysis Using Infrared Dye-Labeled Primers and anAutomated DNA Sequencer. A.A. Myburg, D.L. Remington, D.M. O'malley, R.R.Sederoff, and R.W. Whetton. BioTechniques 2001, 30(2): 348-357.
3. Construction of an AFLP® genetic map with nearly complete genome coverage in Pinus taeda. D.L. Remington, R.W. Whetten, B.-H. Liu, D.M. O'Malley.Theoretical Applied Genetics 1999, 98:1279-1292. 
4. NA Inter-MITE polymorphisms (IMP): a high throughput transposon-based genomema pping and fingerprinting approach. R.-Y. Chang, L.S. O'Donoughue, and T.E. Bureau. Theoretical Applied Genetics 2001, 102:773-781.

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