结晶紫染色测定细胞数

1． 在 96 孔细胞培养板各孔中加 0.1ml 含 5 × 10⁴ ～ 10 × ⁴ WEHI-164 细胞的培养液（含 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培养液）， 37 ℃ 5 ％ CO₂ 的二氧化碳培养箱中培养 2 ～ 3 小时，让细胞帖壁。

2． 用 RPMI-1640 培养液 10 倍递次稀释 TNF 标准品，根据需要 3 ～ 5 倍递次稀释待检样品，每孔加 0.1ml 稀释的标准品或待检样品，每个稀释度 3 个重复孔。对照孔 6 个， 3 个阳性对照孔各加 0.1ml 含 4 μ g TNF 的 RPMI-1640 培养液， 3 个阴性对照孔各加 100 μ l RPMI-1640 培养液。继续培养 18 ～ 24 小时。

3． 甩去培养液，用 PBS 小心洗涤一次，每孔加 0.1ml 10 ％甲醇溶液固定细胞 30 秒钟。

4． 吸去甲醇溶液，每孔加 0.1ml 结晶紫染液，室温中放置 20 分钟。

5． 轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或 37 ℃烘干。此板可以在室温中长期保存。

6． 测定前，每孔加 0.1ml 33 ％醋酸脱色，充分振荡后在 570nm 处测定光吸收度。用光吸收度（ OD ）值对样品稀释度作图，比较标准品曲线和待检样品曲线即可得到待测样品中的细胞因子活性