结晶紫染色法测定细胞数
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1.在96孔 细胞培养 板各孔中加0.1ml含5×104~10×4 WEHI-164细胞的培养液(含10%小牛血清的RPMI-1640培养液),37℃ 5% CO2的二氧化碳培养箱中培养2~3小时,让细胞帖壁。
2.用RPMI-1640培养液10倍递次稀释TNF标准品,根据需要3~5倍递次稀释待检样品,每孔加0.1ml稀释的标准品或待检样品,每个稀释度3个重复孔。对照孔6个,3个阳性对照孔各加0.1ml含4μg TNF的RPMI-1640培养液,3个阴性对照孔各加100μl RPMI-1640培养液。继续培养18~24小时。
3.甩去培养液,用PBS小心洗涤一次,每孔加0.1ml 10%甲醇溶液固定细胞30秒钟。
4.吸去甲醇溶液,每孔加0.1ml结晶紫染液,室温中放置20分钟。
5.轻轻甩去染色液,用 蒸馏 水洗涤各孔,将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。此板可以在室温中长期保存。
6.测定前,每孔加0.1ml 33%醋酸脱色,充分振荡后在570nm处测定光吸收度。用光吸收度(OD)值对样品稀释度作图,比较标准品曲线和待检样品曲线即可得到待测样品中的 细胞因子 活性