细胞生长检测9：染料染色法测定细胞数
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染料染色法测定细胞数
1 ）结晶紫检测法
1． 在 96 孔细胞培养板各孔中加 0.1ml 含 5 × 104 ～ 10 × 4 WEHI-164 细胞的培养液（含 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培养液）， 37 ℃ 5 ％ CO2 的二氧化碳培养箱中培养 2 ～ 3 小时，让细胞帖壁。
2． 用 RPMI-1640 培养液 10 倍递次稀释 TNF 标准品，根据需要 3 ～ 5 倍递次稀释待检样品，每孔加 0.1ml 稀释的标准品或待检样品，每个稀释度 3 个重复孔。对照孔 6 个， 3 个阳性对照孔各加 0.1ml 含 4 μ g TNF 的 RPMI-1640 培养液， 3 个阴性对照孔各加 100 μ l RPMI-1640 培养液。继续培养 18 ～ 24 小时。
3． 甩去培养液，用 PBS 小心洗涤一次，每孔加 0.1ml 10 ％甲醇溶液固定细胞 30 秒钟。
4． 吸去甲醇溶液，每孔加 0.1ml 结晶紫染液，室温中放置 20 分钟。
5． 轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或 37 ℃烘干。此板可以在室温中长期保存。
6． 测定前，每孔加 0.1ml 33 ％醋酸脱色，充分振荡后在 570nm 处测定光吸收度。用光吸收度（ OD ）值对样品稀释度作图，比较标准品曲线和待检样品曲线即可得到待测样品中的细胞因子活性
2 ） NBB 检测法
1． 在用细胞因子处理靶细胞以后倾去培养液，倒置培养板于吸水纸上吸干培养液。再用 100 μ l 磷酸缓冲盐水小心洗去死细胞，用吸水纸吸干培养液。
2． 每孔加 100 μ l NBB 染液，室温中染色 30 分钟。轻轻染液。用吸水纸吸干染液。
3． 每孔加 100 μ l 福尔马林固定液固定 15 分钟。用自来水轻轻洗去固定液，倒置培养板，用吸水纸吸干染液。
4． 每孔加 150 μ l 50mmol/L 氢氧化钠。轻轻振荡培养板直到染料全部溶解并均匀分布。在分光光度计上读取各孔在 620nm 处的光密度（ OD ）值。计算 TNF 的活性。
3 ）美蓝染色检测法
1． 用细胞因子处理靶细胞，在含 100 μ l 细胞培养液的检测孔中，每孔加 0.02ml 25 ％戊二醛固定活细胞 15 分钟，用自来水缓缓洗去死细胞和固定液。
2． 每孔加 0.1ml 0.05 ％美蓝染液，染色 20 分钟，用自来水缓缓冲净染液，晾干。
3． 每孔加 0.2ml 0.33mol/L 盐酸溶解美蓝，振荡混匀。在 665nm 波长处测定光吸收度。计算 TNF 的活性。
4 ）中性红染色检测法
1． 用细胞因子处理靶细胞，在含 100 μ l 细胞培养液的检测孔中，每孔加 50 μ l 5 ％中性红染液。继续培养 2 小时。
2． 小心倒去培养液。用 200 μ l Hanks 液洗涤细胞 1 次。小心倒去培养液，减少细胞丢失。
3． 每孔加 100 μ l 脱色液，在摇床中轻轻摇晃溶解 30 分钟。在 550nm 波长处测定 OD 值。
