免疫染色法滴度测定

MVA 病毒滴度通常是用免疫染色法进行测定，因为 MVA 不能在 CEF 或 BHK-21 细胞中形成噬斑。

1. 胰酶消化用 150 cm² 组织培养瓶培养的 CEF 或 BHK-21 细胞（见「细胞培养实验」基本方案 1 步骤4～6 )，对较大的组织培养瓶用 1.5 ml 胰酶/EDTA 消化。用 5 ml 的完全 MEM-10 培养基重悬细胞，另加入 60 ml 的完全 MEM-10 培养基。

2. 在 6 孔的 35 mm² 组织培养板每孔中加入 2 ml 的细胞悬液，在加湿的 5% CO₂ 培养箱中 37°C 培养过夜至接近单层生长至汇片的程度。

3. 吸出培养基，加入 2 ml 完全 MEM-2.5 培养基。

4. 取出 MVA 病毒储液，在冰上超声破碎 30 s。

5. 用完全 MEM-2.5 培养基对病毒进行 8 次 10 倍系列稀释，注意每次稀释必须用新的吸管。

6. 用 0.1 ml 10^-6、10^-7、10^-8 病毒稀释液感染细胞，每个稀释度感染两个孔，旋转混匀，放入 CO₂ 培养箱中 37°C 培养 24 h。

7. 吸出液体，将细胞用 1 ml 1:1: 丙酮/甲醇固定 2 min。吸出固定液，每孔加入 2 ml PBS，立即免疫染色培养板，也可以将培养板在 4°C 存放数周后使用。

8. 用含 3% FBS 的 PBS 稀释兔抗痘苗病毒抗体，每孔加入 1 ml。室温温育 1 h，期间并不时轻轻晃动。

9. 用 2 ml 的 PBS 清洗 2 次。

10. 用含 3% FBS 的 PBS 稀释辣根过氧化物酶偶联的抗兔 Ig 抗体，每孔加入 1 ml。室温温育30～45 min，期间不时轻轻晃动。

11. 用 2 ml 的 PBS 清洗 2 次。

12. 用 0.5 ml 的乙醇制备邻联茴香胺饱和溶液，涡旋混匀，37℃ 下放置 5 min，以最大转速离心 1 min 澄清溶液，加入 0.2 ml 的邻联茴香胺溶液到 10 ml 的PBS/H₂O₂ 中。同样，也可以按照操作手册使用底物片剂。

13. 每孔加入 0.5 ml 的邻联茴香胺底物溶液，轻轻晃动，放置10 min (弱抗体需要的时间长）。用显微镜观察感染细胞的噬斑，反应完成后，用水洗培养板，并加入 1 ml 的水使其保持湿润。

14. 对染色的噬斑进行计数，乘以稀释倍数，得到的滴度表示为感染单位（pfu）/ml。

1. 邻联二茴香胺有致癌作用，操作时应该戴手套并在通风橱中进行。30% H₂O₂ 对皮肤有腐蚀性，应戴手套操作。

2. 每个抗体的最佳稀释倍数必须以经验确定，但最好开始按 1:500 或 1:1000 稀释。

3. 每孔中有 20～100 个噬斑可以获得较好的结果。在确定滴度时，应当乘以10，因为每孔只加入了 0.1 ml的病毒量。