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噬菌体扩增及滴度测定

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请教有关噬菌体分离扩增测滴度纯化等的相关问题,首先是如何从污水或标本中获取,可能这些问题比较傻,但是本人是新手,敬请指教,不要取笑!谢谢!

我们实验室的噬菌体扩增及测滴度方法:

第一天:

17:00后用接种环取一单克隆细菌接种于LB培养液中,370C摇床过夜(不要超过16小时)

第二天:

7:30打开紫外灯,照射半小时(将器械放入通风橱中)

8:00将20ML的LB培养液放入250ml的三角烧瓶中,按1:100的比例稀释过夜培养的细菌(即放入200ul 的细菌液体),将其放入370C摇床,培养约3.5个小时

11:00打开紫外灯,照射半小时

11:30取10ul阳性噬菌体液加至20ml细菌培养物中(早期对数生长期),再放入摇床中370C剧烈摇动(300转/分)4.5小时

15:30打开紫外灯,照射半小时。同时让高速离心机预温。

16:00将三角烧瓶中培养物转至一离心管中,40C 10,000rpm离心10min,将上清转至另一干净离心管中,再次离心。吸取部分上清按1:1的比例和甘油混合保种,放在-200C保存。吸取80%上清至另一离心管中,加1/6体积PEG/NACL,于40C过夜。

17:00用接种环取一单克隆细菌接种于LB培养液中,370C摇床过夜(不要超过16小时)。

第三天:

7:30打开紫外灯,照射半小时(将器械放入通风橱中)

8:00按1:100的比例稀释过夜培养的细菌(将50ul的细菌培养物放入5mlLB中)将其放入370C摇床,培养约3.5小时

8:30打开紫外灯,照射半小时(将器械放入通风橱中),同时让高速离心机预温。

9:0040C10,000rpm离心15min,弃上清。加1mlTBS重悬沉淀,并转移至微量离心管中,加1/6体积的PEG/NACL再次沉淀,在冰上孵育15-60min,离心弃上清,加200ulTBS重悬沉淀,此为阳性噬菌体扩增液。经几轮扩增至所需的滴度。

10:30将IPTG/Xgal平皿板放入370C恒温箱中预温,准备水浴箱等测滴度用品。

11:00用LB培养液以100/1000倍系列稀释噬菌体。微波炉中溶化顶层胶,每3ml分装在一个无菌培养管中,每个稀释度的噬菌体一个,将这些培养管置于450C水浴中备用。

11:30每200ul细菌培养物分装到微量离心管中。每个噬菌体稀释度10ul分别加到上述细菌培养物中,室温下孵育1-5分钟。转到上述含顶层胶的无菌培养管中,快速混悬,立即铺到预温的LB/IPTG/Xgal平皿上,倾斜平皿使顶层胶铺匀。室温下冷却平皿5min,倒置,370C培养过夜。

第四天:

噬斑计数,以每个平皿100个左右为最佳的稀释度。

噬菌体滴度=噬斑数×稀释度(pfu/10ul)

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