噬菌体扩增、测滴度方法

第一天

17：00：后用接种环取一单克隆细菌接种于LB培养液中，37°C摇床过夜（不要超过16小时）

第二天

7：30：打开紫外灯，照射半小时（将器械放入通风橱中）；8：00：将20mL的LB培养液放入250mL的三角烧瓶中，按1：100的比例稀释过夜培养的细（即放入200ul 的细菌液体），将其放入37°C摇床，培养约3.5个小时；11：00：打开紫外灯，照射半小时；11：30：取10μL阳性噬菌体液加至20mL细菌培养物中（对数生长期早期），再放入摇床中37°C剧烈摇动（300转/分）4.5小时；15：30：打开紫外灯，照射半小时。同时让高速离心机预温；16：00：将三角烧瓶中培养物转至一离心管中，40°C ，10，000rpm离心10min，将上清转至另一干净离心管中，再次离心。

吸取部分上清按1：1的比例和甘油混合保种，放在－200C保存。吸取80％上清至另一离心管中，加1/6体积PEG/NACL，于40°C过夜；17：00用接种环取一单克隆细菌接种于LB培养液中，37°C摇床过夜（不要超过16小时）。

第三天

7：30：打开紫外灯，照射半小时（将器械放入通风橱中）； 8：00：按1：100的比例稀释过夜培养的细菌（将50μl的细菌培养物放入5mlLB中）将其放入370C摇床，培养约3.5小时；8：30：打开紫外灯，照射半小时（将器械放入通风橱中），同时让高速离心机预温；9：00：40°C 10，000rpm离心15min，弃上清。加1mlTBS重悬沉淀，并转移至微量离心管中，加1/6体积的PEG/NACL再次沉淀，在冰上孵育15－60min，离心弃上清，加200ulTBS重悬沉淀，此为阳性噬菌体扩增液。

经几轮扩增至所需的滴度；10：30：将IPTG/Xgal平皿板放入37°C恒温箱中预温，准备水浴箱等测滴度用品；11：00：用LB培养液以100/1000倍系列稀释噬菌体。微波炉中溶化顶层胶，每3mL分装在一个无菌培养管中，每个稀释度的噬菌体一个，将这些培养管置于45°C水浴中备用；11：30：每200ul细菌培养物分装到微量离心管中。每个噬菌体稀释度10uL分别加到上述细菌培养物中，室温下孵育1－5分钟。转到上述含顶层胶的无菌培养管中，快速混悬，立即铺到预温的LB/IPTG/Xgal平皿上，倾斜平皿使顶层胶铺匀。室温下冷却平皿5min，倒置，37°C培养过夜。

第四天

噬斑计数，以每个平皿100个左右为最佳的稀释度。噬菌体滴度＝噬斑数×稀释度（pfu/10uL）