人NK细胞高效扩增方法总结

NK细胞是人体免疫的第一道防线，具有非限制性杀伤的特点，如何发挥NK细胞的免疫作用从而治疗肿瘤等疾病是一个重要的课题。因为NK细胞仅占外周血的5-10%，细胞数量的稀少往往是制约研究的一个重要原因。本产品用于从单个核细胞（MNC）在体外高效扩增成NK细胞，具有扩增效率高，目的细胞百分比高的特点，起始单个核细胞经过14天培养，总细胞数可以扩增约50倍左右，NK细胞数可以扩增500倍以上，且纯度可达70%-85%（由于个体差异，有的样品诱导后NK细胞纯度低于70%或高于85%）。

 

【操作步骤】

一 血浆的提取与保存

注意：

1）禁止使用EDTA抗凝的血样，因为EDTA会极大影响NK细胞的激活与增殖；

2）所取血样最好不超过12小时，因为血样的时间越长，所提取的PBMC中杂细胞越多，且PBMC的活性会降低；

1.将取到的外周血置于50mL离心管中，室温下650g，离心15min；

2.取上层黄色血浆部分于新的50mL离心管中（下层为血液细胞成分，用于后续单个核细胞的提取）；

3.将血浆置于56°C水浴锅中灭活30min；

4.血浆灭活完毕后，可见血浆呈现浑浊状，900g，离心10min；

5.取上清，于-20°C冷冻15min；

6.冷冻完毕后，再次900g，离心10min，取上清，于4°C保存待用。

 

二 单个核细胞的提取

1.取血浆提取步骤的下层红色细胞沉淀，加入生理盐水或PBS至原体积；

2.取2支50mL离心管，分别加入15mL 淋巴细胞分离液，并将1步骤中的稀释血液分别缓缓铺加到淋巴细胞分离液的上层；

注意：铺加血样时建议速度适中，尤其是刚开始时的铺加， 避免破坏淋巴细胞分离液与血样的界面。

3.室温下，800g 离心20min（无闸减速）；

4.离心后，离心管中样品由上到下分为 4 层：血浆层-白膜层-人淋巴细胞分离液层-红细胞与粒细胞的沉淀。分别小心吸取白膜层及其以下约一半的液体于新的离心管中，并加入生理盐水或PBS至40mL体积，混匀，300g离心10min；

5.弃上清，沉淀再次用40mL的生理盐水或PBS重悬，300g离心10min；

6.弃上清，沉淀少许NK-IV培养基重悬，合并，取部分细胞悬液计数，备用。

 

三 单个核细胞接种与补液

1.T75瓶包被 将7mL PBS加入到T75细胞培养瓶中，再将NK-I加入到T75瓶中，充分混匀后，将细胞培养瓶水平静置于二氧化碳培养箱37°C孵育2h（不能低于1h）。孵育完毕后，吸去包被液，再用10mL PBS轻柔摇晃洗涤细胞培养瓶，弃去清洗液待用；

注意：

1）细胞培养瓶必须是经TC处理的培养瓶，严禁使用未经TC处理的培养瓶以及经过特殊处理专用于干细胞培养的培养瓶；

2）包被培养瓶时要水平放置，并要求包被液完全覆盖培养瓶底面；

3）若包被瓶未能及时使用，可将培养瓶用封口膜封口，置于4°C保存2天。

2.第0天，配制50mL NK细胞完全培养基：NK-IV培养基45mL，10%已热灭活的自体血浆（5mL），NK-II 300μL，NK-III 250mg（NK-III为每支500mg，用1mLNK-IV培养基溶解，取一半用于本试剂盒）以及 IL-2（完全培养基中IL-2终浓度为1000IU/mL），将制备好的单个核细胞（MNC）按1-1.5M cells/mL的细胞密度接种于已包被的含有50mL NK细胞完全培养基的T75瓶中；

注意：

1）每支IL-2 使用1mL NK-IV培养基溶解后，可存于2-8°C冰箱，存放时间不超过两周。建议将IL-2溶解后分装于无菌试剂管后保存于-20°C冰箱，使用时溶解即可，注意不要反复冻融，且不可使用长期置于2-8°C的IL-2，否则将严重影响本试剂盒的扩增效果；

2）在细胞接种后与第3天补液之前的这段时间内，尽可能不要移动培养瓶，以免使其受到温度变动，震荡等物理因素的干扰。

3）NK-IV在使用前，需先将其室温平衡30min以上，切勿将培养基直接从冰箱中拿出使用，否则可能导致细胞出现应激反应。

3.第3天（3×24h），补加NK-IV培养基95mL，5%已热灭活的自体血浆（5mL）以及IL-2（IL-2终浓度为1000IU/mL），转入细胞培养袋，此时培养袋含150mL培养基；

注意：

为使更多的细胞转入到培养袋中，可先将T-75瓶中的细胞吹打均匀，全部转入培养袋中，再用部分新鲜配制的培养液润洗培养瓶，并再次转入培养袋中，最后补齐培养液即可；

4.第5天，往培养袋补加NK-IV培养基150mL，1%已热灭活的自体血浆1.5mL以及IL-2（IL-2终浓度为1000IU/mL），此时袋子含300mL培养液；

5.第7天，往培养袋补加NK-IV培养基300mL，剩余的所有自体热灭活血浆以及IL-2（IL-2终浓度为1000IU/mL），然后分成两袋，此时每个袋子含300mL培养液；

6.第9天，分别往每个培养袋补加NK-IV培养基300mL以及IL-2（IL-2终浓度为1000IU/mL），此时每个袋子含600mL培养液；

7.第11天，分别往每个培养袋补加NK-IV培养基400mL以及IL-2（IL-2终浓度为1000IU/mL），此时每个袋子含1000mL培养液；

8.第13天，或14天，收获NK细胞。