合作专家 | 李煜钰博士
病理学与病理生理 首都医科大学
审核专家 | 于涛博士
生物化学分子生物 中国科学院大学
简介
染色质可及性通常也理解为染色质的开放程度。DNA 的复制以及转录，都需要将染色质的紧密结构打开，从而允许一些调控蛋白（比如转录因子和辅因子）与 DNA 结合。这部分被打开的染色质被称为开放染色质，其允许调控蛋白结合的特性称为染色质的可及性。
ATAC-seq（Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing），即利用转座酶 Tn5 研究染色质可及性的高通量测序技术，是目前针对染色质可及性测序的首选方法。
原理
ATAC-Seq 技术的原理是利用转座酶 Tn5 能够识别结合开放染色质区的 DNA，对其进行切割并在其两端加上特定序列的特性。如下图所示，只要将携带已知 DNA 序列标签的转座复合物（即带红色和蓝色序列标签的 Tn5 转座酶）加入到细胞核中一起孵育，再利用已知序列标签进行 PCR 扩增即可形成文库，经过测序并与基因组比对就可以获得染色质开放区的信息。
ATAC 转录和文库构建过程 Nat Protoc. 2022 Jun;17（6）:1518-1552.
用途
（1）绘制染色质开放性图谱；
（2）寻找调控生物学过程的关键转录因子；
（3）寻找转录因子调控的靶基因；
（4）增强子的鉴定及发现；
（5）寻找核小体的定位；
（6）探索与疾病有关的调控机制。
材料与仪器
样品准备：
① 待测样品（可以是细胞、动物组织、植物组织等）
② 1x PBS
③ 冻存液
④ 细胞核提取试剂盒（Dithiothreitol（DTT）、Ribolock RNase Inhibitor）、
⑤ 无酶 EP 管
⑥ BSA
步骤
样品准备：
（1）细胞样品：
a) PBS 清洗细胞两遍，贴壁细胞用 0.5% 胰酶消化成悬浮细胞；
b) 用含 10% FBS 的 DMEM 中止消化；
c) 将中止消化的细胞 4 °C、500 g 离心 5 分钟，小心吸掉全部上清；
d) 用冻存液（60% 完全培养基+ 30% FBS + 10% DMSO）（体积比）重悬细胞沉淀，按照上面规定的细胞量进行分装，移至冻存管；
e) 将冻存管置于程序降温冻存盒，放到 -80 度冰箱进行梯度降温并暂时保存；
f) 干冰送至测序公司；
（2）动物/植物组织样品：
a) 取下新鲜组织样本，去除多余组织等杂质；
b) 将组织样本转移至新的离心管中，用预冷的 PBS 溶液冲洗干净;
c) 用无尘纸擦干水分，如果组织体积较大，应在冰上将组织切成小块或薄片（每份约 50 mg）；之后置于 2 ml 旋盖冻存管内，准备标记样本名称;
d) 迅速置于液氮中冷冻 30 mins，然后转移至 -80 度冰箱中保存；
e) 干冰中冻存送至测序公司；
1, 组织（细胞）细胞核提取
（1）根据细胞核分离试剂盒说明书完成
（2）LB 溶液中加入 BSA，终浓度为 1%，现配现用
（3）取 2 ml EP 管，加入 1 ml LB
（4）向样本中加入裂解液，匀浆仪打碎研磨
（5）冰上充分裂解 5～10 分钟
（6）40 μm 细胞筛去除杂质，4 ℃，500 g 离心 5 分钟
（7）弃上清，加入 300 μl LB 溶液，重悬，转移至新的 EP 管中
（8）加入 300 μl PB1 溶液，吹打混匀
（9）缓慢在溶液底层加入 600 μl PB2 溶液，使得溶液分层
（10）缓慢在溶液底层加入 600 μl PB3 溶液，使得溶液分层
（11）4 ℃，3000 g 离心 20 分钟
（12）细胞核位于 PB2 和 PB3 溶液交界处，依次移除最上层 600 μl 上清，细胞核层以上 500 μl 体积的液体
（13）加入 NB 溶液吹打混匀，过细胞筛，4 ℃ 500 g 离心 5 分钟
（14）缓慢吸除上清，加入 0.5 mL NB 溶液，重悬
（15）4 ℃ 500 g 离心 5 分钟，去上清，加入 50 μl NB 溶液，吹打重悬细胞核
（16）分别取 5 μl 细胞核悬液，台盼蓝染色，用于细胞核计数核显微镜观察
2, Tn5 酶转座反应
（1）在 PCR 管中配置如下打断 Mix：
（2）用打断 Mix 重悬细胞核，并用移液器轻轻吹打混匀；
（3）PCR 仪 37℃ 反应 30 min（可根据安捷伦 2100 结果适当延长时间）；
3, DNA 纯化、建库、上机测序
（1）利用 VAHTS DNA Clean Beads（使用前先恢复至室温）纯化 DNA：
（2）磁珠和上述 PCR 产物混匀，室温孵育 5 min；
（3）将 PCR 管置于磁力架上，用 200μl 新鲜配置的 80% 乙醇漂洗两次，随后小心移除上清；
（4）开盖干燥 5 min；
（5）磁珠晾干后，用 22 μl 双蒸水洗脱磁珠上的 DNA；
（6）随后用 P5/P7 引物 PCR 扩增建库；
（7）得到的文库再用 VAHTS DNA Clean Beads 纯化；
（8）用 Q-bit 测定文库浓度，安捷伦 2100 检测文库片段分布；
（9）文库交由测序公司测序。
4, 生物信息学分析（根据个人需求进行分析）
注意事项
1. 在样本制备过程中，应将提前配置细胞冻存液置于冰上预冷，防止新配置的冻存液过热损伤细胞，待冻存液恢复室温后使用。
2. 样本送样时最好额外制备 1～2 份进行备份，以防后续实验出现差错无法补救。
3. 在细胞核提取相关实验中，所有试剂均需要添加蛋白酶抑制剂、RNase 抑制剂及 DTT。
4. 在细胞核提取相关实验中，LB 溶液中加入 BSA，终浓度为 1%，应现配现用。
来源：丁香实验
