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单克隆抗体技术:细胞融合

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1976

融合剂

 

细胞融合的方法有物理法,如电融合、激光融合,化学融合法和生物融合法,如仙台病毒,此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。

聚乙二醇( PEG ),在分子量为 200 700 时,呈无色、无臭的粘稠状液体,分子量大于 1 000 时,呈乳白色蜡状固体,能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂,对热稳定,与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为 4 000 者,常用浓度为 50 %, pH8.0 pH8.2 (用 10 NaHCO3 调整),分子量小的 PEG ,融合效应差,又有毒性,分子量过大,则粘性太大,不易操作。 50 %浓度, pH 偏碱时融合效应最高。

也有采用 30% 50 %浓度的 PEG 加上 10 %二甲亚砜。

不同批号的 PEG ,即使分子量相同,但融合率却有明显差异,选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的,一般选供气相色谱用的 PEG

 

 

 

融合过程

 

融合的方法很多,常用的有转动法和离心法。

融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为 1 : 1 10 : 1 不等。 3 : 1 5 : 1 最为常用。

1 .试剂与材料

(1) 供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。

(2) 1640 培养液 100ml

(3) 完全 1640 100ml

(4) 2.5 FCS 1640 50ml

(5) HAT 培养液 100ml

(6) 50 PEG :取分子量 4 000 ,高纯度的(日本进口或 Serva PEG10g 放入 25ml 瓶中高压灭菌,使用前用预热于 40 1640 10ml 等量( W/V )混合,以酚红检查 pH ,一般不必调 pH 。如 pH 有改变,可用 HCl NaHCO3 调整。

(7) 10ml 50ml 的灭菌沉淀管或瓶。

(8) 40 孔塑料培养盘。

2 .操作方法

准备好脾细胞。

50ml 沉淀管中混合 108 脾细胞和 107 小鼠骨髓瘤细胞,并加入 50ml 2.5 FCS 1640 液。

室温 400g 离心 3min ,使细胞沉淀。

移去上清液。

轻敲管底部,使沉淀流动,把沉淀管放于 40 水浴中,使其达融合温度。

加预热至 40 50 PEG 0.8ml ,用 1ml 吸管缓慢滴加,边加边摇沉淀管,肉眼观察可见有颗粒出现,滴加过程要求持续 2min

1ml1640 液,边加边摇动,持续 1min

⑻重复⑺一次。

1ml 1640 液,边加边摇动,持续 0.5min

重复⑼一次。

1640 15ml

室温, 400g 离心 1min ,使细胞沉淀。

⒀去上清,轻敲管底部,加 25ml 含有 HAT 的完全 1640 液。

往已于前一日种有饲养细胞的 40 孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液,每孔 1 滴(约 0.05ml )。

轻摇后,放入 5 CO2 饱和湿度的 37 温箱中培育。

3 6 9 10 日换入含 HAT 的完全 1640 培养液。注意轻轻吸取上清液,勿将固定于孔底的细胞吸出,根据需要加入适量的饲养细胞。

于第 12 15 日加入含有 HAT 的完全 1640 培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察,大约在 10 天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在 10~20 天内出现,但也有在 1 个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后,吸取上清液,检查抗体。

对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中,依情况取消 HAT 液和完全 1640 液而代之以 10黃 1640 液。同时保存于液氮和进行克隆化,在这期间每代都要检查抗体,以防止产生抗体细胞的变异和丢失。

 

 

 

细胞融合的关键

 

1 .技术上的误差常常导致融合的失败。例如,供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。

2.融合试验最大的失败原因是污染,融合成功的关键是提供一个干净的环境,以及适宜的无菌操作技术。

 

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