单克隆抗体技术：细胞融合

互联网2013-11-14

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融合剂

细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。

聚乙二醇（ PEG ），在分子量为 200 ～ 700 时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于 1 000 时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为 4 000 者，常用浓度为 50 ％， pH8.0 ～ pH8.2 （用 10 ％ NaHCO3 调整），分子量小的 PEG ，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。 50 ％浓度， pH 偏碱时融合效应最高。

也有采用 30% ～ 50 ％浓度的 PEG 加上 10 ％二甲亚砜。

不同批号的 PEG ，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的，一般选供气相色谱用的 PEG 。

融合过程

融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。

融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为 1 : 1 至 10 : 1 不等。 3 : 1 或 5 : 1 最为常用。

1 ．试剂与材料

(1) 供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。

(2) 1640 培养液 100ml 。

(3) 完全 1640 液 100ml 。

(4) 2.5 ％ FCS － 1640 液 50ml 。

(5) HAT 培养液 100ml 。

(6) 50 ％ PEG ：取分子量 4 000 ，高纯度的（日本进口或 Serva ） PEG<chmetcnv>10g</chmetcnv> 放入 25ml 瓶中高压灭菌，使用前用预热于 <chmetcnv>40 ℃ </chmetcnv> 的 1640 液 10ml 等量（ W/V ）混合，以酚红检查 pH ，一般不必调 pH 。如 pH 有改变，可用 HCl 或 NaHCO3 调整。

(7) 10ml 和 50ml 的灭菌沉淀管或瓶。

(8) 40 孔塑料培养盘。

2 ．操作方法

⑴ 准备好脾细胞。

⑵ 在 50ml 沉淀管中混合 108 脾细胞和 107 小鼠骨髓瘤细胞，并加入 50ml 2.5 ％ FCS － 1640 液。

⑶ 室温 <chmetcnv>400g </chmetcnv> 离心 3min ，使细胞沉淀。

⑷ 移去上清液。

⑸ 轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于 <chmetcnv>40 ℃ </chmetcnv> 水浴中，使其达融合温度。

⑹ 加预热至 <chmetcnv>40 ℃ </chmetcnv> 的 50 ％ PEG 0.8ml ，用 1ml 吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续 2min 。

⑺ 加 1ml1640 液，边加边摇动，持续 1min 。

⑻重复⑺一次。

⑼ 加 1ml 1640 液，边加边摇动，持续 0.5min 。

⑽ 重复⑼一次。

⑾ 加 1640 液 15ml 。

⑿ 室温， <chmetcnv>400g </chmetcnv> 离心 1min ，使细胞沉淀。

⒀去上清，轻敲管底部，加 25ml 含有 HAT 的完全 1640 液。

⒁ 往已于前一日种有饲养细胞的 40 孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液，每孔 1 滴（约 0.05ml ）。

⒂ 轻摇后，放入 5 ％ CO2 饱和湿度的 <chmetcnv>37 ℃ </chmetcnv> 温箱中培育。

⒃ 第 3 、 6 、 9 、 10 日换入含 HAT 的完全 1640 培养液。注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。

⒄ 于第 12 、 15 日加入含有 HAT 的完全 1640 培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在 10 天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在 10~20 天内出现，但也有在 1 个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。

⒅ 对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消 HAT 液和完全 1640 液而代之以 10黃 － 1640 液。同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。

细胞融合的关键

1 ．技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。

２．融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。