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单克隆抗体技术:细胞融合

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(一)融合剂

细胞融合的方法有物理法,如电融合、激光融合,化学融合法和生物融合法,如仙台病毒,此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。

聚乙二醇(PEG),在分子 量为200~700时,呈无色、无臭的粘稠状液体,分子量大于1000时,呈乳白色蜡状固体,能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂,对热稳定,与许多化学药品不起作用。

用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者,常用浓度为50%,pH8. 0~pH8. 2(用10%NaHCO3调整),分子量小的PEG,融合效应差,又有毒性,分子量过大,则粘性太大,不易操作。50%浓度,pH偏碱时融合效应最高。

也有采用30%~50%浓度的PEG加上10%二甲亚砜。

不同批号的PEG,即使分子量相同,但融合率却有明显差异,选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的,一般选供气相色谱 用的PEG。

(二)融合过程

融合的方法很多,常用的有转动法和离心法。

融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或5:1最为常用。

1. 试剂与材料

(1) 供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。

(2) 1640培养液100 ml。

(3) 完全1640液100 ml。

(4) 2. 5%FCS-1640液50 ml。

(5) HAT培养液100 ml。

(6) 50%PEG:取分子量4 000,高纯度的(日本进口或Serva)PEG 10 g放入25 ml瓶中高压灭菌,使用前用预热于40 ℃的1640液10 ml等量(W/V)混合,以酚红检查pH,一般不必调pH。如pH有改变,可用HCl或NaHCO3调整。

(7) 10 ml和50 ml的灭菌沉淀管或瓶。

(8) 40孔塑料培养盘。

2. 操作方法

⑴ 准备好脾细胞。

⑵ 在50 ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞,并加入50 ml 2. 5%FCS-1640液。

⑶ 室温400 g离心3 min,使细胞沉淀。

⑷ 移去上清液。

⑸ 轻敲管底部,使沉淀流动,把沉淀管放于40 ℃水浴中,使其达融合温度。

⑹ 加预热至40 ℃的50%PEG 0.8 ml,用1 ml吸管缓慢滴加,边加边摇沉淀管,肉眼观察可见有颗粒出现,滴加过程要求持续2 min。

⑺ 加1 ml1640液,边加边摇动,持续1 min。

⑻重复⑺一次。

⑼ 加1 ml 1640液,边加边摇动,持续0.5 min。

⑽ 重复⑼一次。

⑾ 加1640液15 ml。

⑿ 室温,400 g离心1 min,使细胞沉淀。

⒀去上清,轻敲管底部,加25 ml含有HAT的完全1640液。

⒁ 往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液,每孔1滴(约0.05 ml)。

⒂ 轻摇后,放入5%CO2饱和湿度的37 ℃温箱中培育。

⒃ 第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液,勿将固定于孔底的细胞吸出,根据需要加入适量的饲养细胞。

⒄ 于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察,大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现,但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后,吸取上清液,检查抗体。

⒅ 对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中,依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS-1640液。同时保存于液氮和进行克隆 化,在这期间每代都要检查抗体,以防止产生抗体细胞的变异和丢失。

(三)细胞融合的关键

1. 技术上的误差常常导致融合的失败。例如,供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。

2. 融合试验最大的失败原因是污染,融合成功的关键是提供一个干净的环境,以及适宜的无菌操作技术。

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