单层全细胞融合实验

基本方案 单层全细胞融合

1.倘若不知道细胞的选择条件，通过以下方式来确定：将培养于 25 cm 培养瓶中的受体细胞传代，比例为 10:1，分装于不同培养瓶中，并用不同水平的选择试剂来培养。

每周 2 次观察细胞，换液，10d 之后确定抑制细胞生长的试剂的最低浓度。

2.在融合前的当天下午，将等量的供体细胞和受体细胞（通常为 5X105?IXlO6 个) 培养于含 IOml 有血清的培养基中，同时分别将供体细胞和受体细胞培养于含或不含 PEG 的培养基来做对照，培养过夜。

供体和受体细胞在选择条件下需死亡，含 PEG 的细胞应该在选择条件下恢复并开始汇合，当一个新细胞系或新的 PEG 使用时，后者的对照需重故。

3.在显微镜下观察细胞，其需 70% 汇合，细胞与细胞之间需接触良好，但互不挤压，若细胞量不够，准备新培养瓶增加培养。

4.将瓶中的培养基吸出，用无血清的培基洗 2 次，并完全将其吸出，将瓶倾斜一段时间同时将最后的培养基吸出。

5.加 2 ml50%PEG 溶液，37°C。将培养瓶来回倾斜使溶液在细胞中快速混匀，让其站立 2 min(时间非常重要），若有必要，通过以下试验来优化条件：peg 浓度为 44%~50%; 单层细胞孵育 2~3 min, 悬浮细胞 2~4 min。

6.将 10 ml 无血清培基轻柔地从皿的一边加人，轻柔颠倒使 PEG 扩散完全，吸出培基并弃去，用无血清培养基重复洗两次，最后一次用 10 ml 有血清培养基洗，由于细胞膜此时非常脆弱，故以上操作均需轻柔。

7.加人 10 ml 有血清培养基，孵育 36~48 h(在该时间段内使细胞扩增 2 次）。

8.用胰酶消化细胞，将其分至 5~10 个 10 cm 培养板中。为了确保选择，板中的细胞浓度需低，以保证细胞在汇合之前能分裂几次。在每个板中加入 10 ml 有血清培养基和合适浓度的选择性试剂（第 1 步），在 37°C 中孵育。

9.每 5d 换一次液直至长出克隆，换了选择性培基后 10?14d 后确认皿中是否有克隆长出。避免损坏细胞或使其长得越来越大，因为移动细胞可能使其长出姐妹克隆。

10.用挑克隆的针将克隆挑出（支持方案 1)。

11.为了避免维持和扩增不需要的细胞系，一旦克隆长出，立即扩增、鉴定（第 3~5 步）及冻存（附录 31)。为避免染色体缺失和重组，传代需少（三代以内细胞使用一个冻存管，1 个 6 cm 培养皿使用 2 个冻存管）。在鉴定细胞系时，需使用多种鉴定方法，在复苏和扩增时需重新鉴定以确保无染色体重组和分离。若有必要，对已分离出额外染色体的细胞系挑亚克隆（支持方案 2)12. 在快速复苏时，将细胞培养至 25 cm 组织培养瓶中，若细胞在冻存后恢复较慢，则增加冻存培养基中的血清含量。

备选方案 悬浮培养供体细胞-单层的供体细胞的全细胞融合

1.消化贴壁生长的受体细胞，在培基中重悬，用血细胞计数器对供体细胞和受体细胞计数，分别取 2XIO 6 个，在 15 ml 扣盖的聚丙烯试管中混勻，维持以确保选择有效。

2.室温 400 g 离心 5 min，在受体细胞中加入 IOml 无血清的培基，再次离心，小心吸出培养基，将试管倾斜以吸干培养基。

3.轻弹试管使团块松散。用移液器吸取 0.3 ml 50% PEG 溶液，37°C，沿管壁加人同时轻摇或轻弹试混勻。室温孵育 3 min。如有必要，可以优化融合条件（基本方案，第 5 步）

4.加入 8 ml 无血清培养基，立即 400g 离心 5 min。

5.小心吸出培养基，再用 IOml 无血清培养基重悬细胞。再次离心。室温下，吸出培养基，用 IOml 血清培养基重悬细胞。洗的过程中要格外小心，因为此时细胞的膜很脆弱。

6.加 3 ml 细胞悬液到每个 IOOmm 组织培养板内。加 ImI 细胞悬液到另一 100 mm 培养板内，作为对照。孵育 36~48 h。

7.用加血清和筛选因子的培养基培养细胞（用未加筛选因子作对照）。

8.准备克隆及其鉴定（基本方案，第 9~12 步）