实验63 吲哚乙酸氧化酶活性的测定

 

实验63 吲哚乙酸氧化酶活性的测定

 

原理

 

　　吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小，对调节体内吲哚乙酸的水平，起着重要的作用，而影响植物的生长。酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法测定。

 

仪器药品

 

　　721型分光光度计　　　　 离心机

　　恒温水浴锅　　　　　　　天平

　　研钵 　　　　　　　　　 试管

　　移液管 　　　　　　　　 烧杯

　　20mmol/L磷酸缓冲液，pH6.0（见附表2）。

　　1mmol/L2，4—二氯酚：称取二氯酚16.3mg用蒸馏水配制成100ml。

　　1mmol/L氯化锰：称取MnCl₂ ·4H₂ O 19.8mg用蒸馏水配制成100ml。

　　1mmol/L吲哚乙酸：称取IAA 17.5mg用少量乙醇溶解，然后将其倒于盛有约90ml蒸馏水的容量瓶中(100ml)，稀释至刻度。

　　吲哚乙酸试剂A或B（任备其中之一）：

　　试剂A：15ml 0.5mol/L FeCl3,300ml浓硫酸（比重为1.84），500ml蒸馏水，使用前混合之即成，避光保存。用时1ml样品中加入试剂4ml。

　　试剂B：10ml 0.5mol/L FeCl3,500ml 35%过氯酸，使用前混合之即成，避光保存。用时于样品中加入试剂。试剂B较试剂A灵敏。

 

操作步骤

 

　　1．将大豆或绿豆种子于30℃温箱中萌发3梍4天，选取生长一致的幼苗，除去子叶，留下胚轴作材料。

　　2．取20株胚轴，称得重量，置研钵中，加入预冷的磷酸缓冲液5ml，石英砂少许，置冰浴中研磨成匀浆。再按100mg鲜重材料加1ml提取液的比例，用磷酸缓冲液稀释之。离心（4000r/min）20分钟，所得上清液即为粗酶液。

　　3．取试管2支，于一试管中加入氯化锰1ml，二氯酚1ml，IAA2ml，酶液1ml，磷酸缓冲液5ml，混合均匀。另一试管中除酶液用磷酸缓冲液代替外，其余成分相同。一起置于30℃恒温水浴中，保温30分钟。

　　4．吸取反应混合液2ml，加入吲哚乙酸试剂B4ml，摇匀，置于30℃的黑暗处保温30分钟，使显色。

　　5．将显色后呈现红色的反应液于分光光度计中测定吸光度，测定时用波长530nm。

　　6．根据读数从标准曲线上查出相应的吲哚乙酸残留量（或从直线方程式计算反应液中IAA的残留量）。

　　7．从开始时加入的吲哚乙酸量减去酶作用后残留的吲哚乙酸量，即得被酶所分解破坏的吲哚乙酸量。以每ml酶液在1小时内分解破坏吲哚乙酸量(μg)表示酶活力的大小。

　　8．配制浓度从0梍25μg/ml的IAA溶液，分别测得吸光度A，然后绘制标准曲线，或计算直线回归方程。